黑线仓鼠MTNR1A的克隆及种群间的遗传多态性分析

摘要

黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)在我国分布广泛,在维护生态系统平衡中起着重要的作用,为农田和草原主要害鼠之一。本研究从分子水平上研究黑线仓鼠的遗传多态性,为综合治理措施的制定提供科学依据。
　　 生物的遗传多样性是引起其存活力、繁殖力差异的主要因为之一,生物遗传多样性的本质是生物体在遗传物质上的变异,即编码遗传信息的核苷酸的改变。一个物种或种群的遗传变异越丰富,对外界环境的适应能力就越强；反之其适应能力就越弱。单核苷酸多态性作为第三代多态性遗传标记,在遗传学中亲缘关系鉴定、遗传图谱构建、遗传多样性分析等研究中应用广泛,发挥着越来越重要的作用,已经成为国内外的研究热点。
　　 褪黑素在多个物种的多个组织中广泛存在,参与生物的昼夜节律、视网膜信号的调节以及季节性繁殖哺乳动物的生殖调控等多种生理功能的调节,其生物学功能的发挥必须与其高亲和性G蛋白耦联受体的结合来实现。过去在黑线仓鼠中研究褪黑素受体国内外未见报道,通过分析比较种群间的单核苷酸变异,可以了解种群内的亲缘关系及进化的有关生物学信息,从而为研究种群遗传多态性及遗传结构提供有力的理论基础。
　　 本实验对山东省三个不同地区黑线仓鼠种群和曲阜两个季节黑线仓鼠种群的遗传多态性进行研究,首先根据GenBank中已注册金仓鼠(Mesocricetus auratus)、黑线毛足鼠(Phodopus sungorus)等近缘物种的MTNR1A序列,利用Primer5.0软件和Olig06.0软件根据引物设计原则设计2对引物,其次分别对黑线仓鼠MTNR1A基因5’端调控区段和外显子1,外显子2部分区段进行PCR扩增,经连接、转化和测序,得到232条序列,最后利用Chromos、ClustalX、DNAman、DnaSP5.0和MEGA3.1等主要的序列分析软件对济宁曲阜、临沂沂南、潍坊临胸三个黑线仓鼠种群之间及曲阜春秋季种群之间的单核苷酸多态性(SNPs)进行了比较分析。
　　 研究结果表明:(1)首次利用PCR法在山东黑线仓鼠种群中(共116个样本)克隆得到.MTNR1A部分序列(约1708 bp),其中包含5’端调控序列(约725 bp)、外显子1(185 bp)和外显子2部分区段(798 bp)。5’端和外显子1区段有多态位点数19个,有55种单倍型,在GenBank注册号为HM099922～HM099976。外显子2区段有多态位点数13个,有18个单倍型,在GenBank注册号为HM099977～HM099994。(2)分析5’端调控序列发现四种调控序列:CAC、GAGA、GC_SP1和GC；发现少量可能是转录起始位点的AT、TA序列；但未发现典型TATA序列和CAAT序列。(3)本实验对曲阜两个不同季节种群研究发现,MTNR1A第290、292、325、716、940位碱基变化分别导致第77、78、109、239和314位氨基酸发生改变,依次是天冬酰胺→丝氨酸、亮氨酸→甲硫氨酸、亮氨酸→缬氨酸、天冬酰胺→丝氨酸、缬氨酸→异亮氨酸。第N77S、F239S、V314I位氨基酸变化只发生在秋季,而第L78M、L109V位氨基酸变化只发生在春季,初步推断与季节变化有关。第251～253位三个位点发生颠换、插入、转换三种碱基连带变化的多态位点,不但可导致氨基酸发生改变,而且可以使编码顺序发生改变,与季节变化无关。
　　 (4)不同种群间遗传多样性存在差异,遗传多样性临朐种群大于曲阜种群,曲阜种群大于沂南种群。
　　 (5)不同种群间黑线仓鼠MTNR1A基因均具有一定遗传分化,但分化不明显,利用NJ系统进化树分析也支持分化不明显的结论。

目录

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课题来源

1 引言

1.1 黑线仓鼠研究现状

1.2 褪黑素受体1A基因研究进展

1.2.1 褪黑素受体发现、命名和分型

1.2.2 褪黑素受体1A基因克隆与结构

1.2.3 褪黑素受体1A基因多态性及其与季节的关联

1.3 遗传多样性与单核苷酸多态性

1.4 研究意义

2 材料与方法

2.1 材料药品

2.1.1 实验材料

2.1.2 试剂与药品

2.1.3 试剂配制方法

2.1.4 仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 基因组DNA的提取

2.2.2 引物设计、合成与稀释

2.2.3 目的片段回收

2.2.4 感受态细胞制备

2.2.5 连接与转化

2.2.6 测序

2.2.7 序列分析

3 结果

3.1 基因组DNA提取结果

3.2 PCR扩增目的DNA结果

3.3 阳性克隆PCR检测结果

3.4 测序结果

3.5 编码序列与其他物种比较

3.6 黑线仓鼠MTNR1A季节间多态性分析

3.7 黑线仓鼠MTNR1A多态性分析

3.8 黑线仓鼠种群间遗传分化

3.9 各种群间黑线仓鼠MTNR1A系统进化

4 讨论

4.1 基因组DNA提取分析

4.2 连接反应的优化

4.3 黑线仓鼠不同季节种群MTNR1A外显子序列多态性分析

4.4 MTNR1A氨基酸变化与季节关联性

4.5 黑线仓鼠MTNR1A编码序列与其他物种比较分析

4.6 黑线仓鼠MTNR1A核苷酸多态性分析

4.7 黑线仓鼠种群间遗传分化的分析

5 结论

参考文献

读研期间已发表的学术论文

致谢