MBTH法测定多糖水解酶活力的研究

摘要

多糖水解酶类是自然界中广泛分布的酶类，几乎每种生物--动物、植物、藻类、细菌、古细菌、真菌，甚至噬菌体中都发现这类酶的存在。已被广泛应用于饲料、食品、医药、能源、造纸、纺织等行业中，成为各个领域的研究热点。3－甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法具有成本低、操作简单、灵敏度高、精密度好和准确度高等优点，近年来已被应用于还原糖的含量检测。由于MBTH法在测定还原糖方面还处于研究阶段，因此本论文首先将MBTH法与传统的多糖水解酶活力检测方法进行比较，并进行检测条件的优化；然后将MBTH法应用于木聚糖酶和溶菌酶的活力测定，建立多糖水解酶活力测定的新方法。并将其应用于海参体壁多糖水解酶的活力测定，研究多糖水解酶在海参自溶过程中的作用。本论文主要包括以下研究内容：
　　 1．对MBTH法、DNS法和铁氰化钾法在还原糖测定方面进行比较研究
　　 用MBTH法、3,5-二硝基水杨酸(DNS)法和铁氰化钾法分别测定了葡萄糖，木糖，岩藻糖，阿拉伯糖，N-乙酰氨基葡萄糖，氨基葡萄糖等六种还原糖，对测定结果的比较分析表明：新方法MBTH法测还原糖的精密度和回收率与DNS法和铁氰化钾法相近；MBTH法测还原糖的灵敏度最高，铁氰化钾法次之，DNS法最低。因此MBTH法特别适合还原糖的微量测定。
　　 2．建立MBTH法测定木聚糖酶活力的新方法
　　 对MBTH法在木聚糖酶活力测定方面进行了研究。首先以木糖为标准品，对MBTH法测还原糖的检测条件进行了研究；其次在最适检测条件下测定木聚糖酶活力，并对该方法在酶活力测定中的几个关键参数进行了深入研究；最后确定了MBTH法测定木聚糖酶的最低检测限和定量限，并进行了方法验证，结果表明：该方法灵敏度高，准确度高，结果稳定，适用于木聚糖酶的活力测定。
　　 3．建立MBTH法测定溶菌酶活力的新方法
　　 对MBTH法在溶菌酶活力测定方面进行了研究。首先以N-乙酰氨基葡萄糖为标准品，对MBTH法的检测条件进行了研究；其次使用半脱乙酰度的壳聚糖为底物，研究了该方法在酶活力测定中的几个关键参数；最后建立了酶反应动力学曲线，确定了动力学参数，并进行了方法验证，结果表明MBTH法适合于溶菌酶的活力测定
　　 4．MBTH法在海参体壁多糖水解酶活力测定中的应用研究
　　 对MBTH法在海参体壁多糖水解酶方面进行了研究。首先通过高效液相色谱测出海参自溶后其体壁多糖含量有所减少，证明海参自溶过程中有多糖水解酶的参与；然后对海参体壁的自溶酶进行提取，分离纯化，测定各收集管酶液的蛋白酶活力，以确定酶活的存在；最后分别以壳聚糖和海参多糖为底物用MBTH法测酶活力。通过实验发现海参体壁存在多糖水解酶。