人类胸苷酸合成酶的原核表达及活性测定

摘要

胸苷酸合成酶（Thymidylate synthase，TS）能催化生物体内的2'-脱氧尿苷-5'-磷酸（dUMP）甲基化形成2'-脱氧胸苷-5'-磷酸（dTMP），后者进一步在细胞内代谢为脱氧胸苷三磷酸（dTTP），dTTP为DNA合成所必需的前体物质。这一反应是细胞内dTMP的唯一来源，所以多年来TS一直是肿瘤化学治疗的重要靶点。研究药物对胸苷酸合成酶的抑制活性以及药物与胸苷酸合成酶的作用机理，就需要大量的纯酶作为前提，传统生物提取难以满足要求。随着基因技术的飞速发展，利用转基因技术手段实现胸苷酸合成酶的体外表达，成为突破此瓶颈的有效手段。
　　 本课题在人TS cDNA不发生定点突变的情况下，以携带野生型人TS cDNA的质粒TS-pcDNA3.1-zeo（+）为模板，通过PCR和TA克隆技术扩增目的基因，并将其与表达载体pET28b（+）连接得到重组表达载体TS-pET28b（+），通过CaCl2转化法将重组质粒TS-pET28b（+）转入到大肠杆菌Rosetta（DE3），然后在Kan抗性的选择培养基筛选出克隆子，利用PCR、双酶切对克隆子进一步进行鉴定，筛选出阳性转化子TS-pET28b（+）/Rosetta（DE3）；重组大肠杆菌在发酵过程中加入诱导剂IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE及Western-Blotting鉴别表明表达产物为含有6×His-tag融合标签的重组人类胸苷酸合成酶；通过L9（33）正交试验确定TS-pET28b（+）/Rosetta（DE3）的最佳诱导条件为：诱导温度37℃，IPTG浓度1.5mM，诱导时间8小时，在最优化条件下重组人胸苷酸合成酶约占菌体总蛋白的43.5％，表达形式主要以包涵体存在。
　　 为了获得高纯度的、具有天然活性的人TS蛋白，本实验利用重组人类TS蛋白中的6×His-tag融合标签，通过固定金属离子亲和层析Ni-NTA进行特异性纯化，获得了纯度为90％以上的TS蛋白；以纯化得到的重组人TS纯化液为原料，利用氧化-还原转化透析系统对其进行体外复性，复性得率为86.67％，复性后人TS的酶活力为0.012U，比活力为0.1U/mg；已知抑制剂培美曲塞（LY231514）和雷替曲塞（Tomudex）对其IC50值分别为:1.0×10-4M、1.0×10-6M。以上结果表明，本实验已经获得了能够高效表达人TS的菌株TS-pET28b（+）/Rosetta（DE3），并且通过体外复性得到了具有天然活性的重组人TS蛋白。