滚环复制放大技术在肿瘤细胞检测及分子逻辑门体系中的应用研究

摘要

随着生存环境的不断恶化，肿瘤和金属离子污染已经严重威胁到人类的健康。化学发光分析法因其操作方便、灵敏度高、设备简单等优点，受到越来越多科研工作者的广泛关注。本论文研制了两种新型适体生物传感器，分别应用于肿瘤细胞的高灵敏度检测和微量金属离子的检测，本文所建立的方法具有高选择性、高灵敏度等优点，在环境保护、临床研究、体外诊断等方面具有十分广泛的应用前景。本论文主要研究内容如下:
　　一、金属离子触发滚环复制放火反应以及它在分子逻辑门体系中的应用
　　Hg2+能使错配的T-T碱基对形成稳定的T-Hg2+-T碱基对，Ag+能使错配的C-C碱基对形成稳定的C-Ag+-C碱基对，这些特性为用于金属离子检测的分子机器的组装和逻辑门体系的执行提供了一种新型通用的技术平台。首先，将探DNA与引物DNA杂交，然后，加入Hg2+或Ag+，在连接酶的作朋下将模板DNA连接成环，然后在DNA聚合酶和dNTPs作用下进行滚环复制放大反应，用标记有荧光素的分子信标与滚环复制的产物杂交，连接上大量的信号探针，大大增强了产物的荧光信号，实现了对Hg2+、Ag+金属离子的高灵敏度检测，同时，由于Hg2+、Ag+与T-T、C-C碱基对之间的特异性结合，也使得本实验具有良好的选择性。
　　二、滚环复制放大技术在肿瘤细胞检测中的应用
　　基于生物条形码纳米技术和滚环复制放大技术，通过细胞适体识别功能，我们提出了一种高灵敏度的检测Ramos细胞的化学发光成像方法。首先，把引物和环状DNA杂交，然后在Klenow聚合酶和dNTPs的作用下进行滚环复制反应，然后让RCA的反应产物与一段段生物素修饰的DNA探针杂交，再加入亲和素修饰的HRP，通过亲和素和生物素的特异性结合，将HRP标记在生物条形码金纳米粒子探针上。同时，将生物素修饰的TE02适体与亲和素修饰的96孔酶标板反应，将TE02适体连接到酶标板的表面，通过与TE02适体和TD05的特异性结合，细胞就能很容易地连接在酶标板的表面。通过Luminol-H2O2-HRP-PIP发光体系，产生光信号。

目录

摘要

第一章 绪论

1 生物传感器

1．1 生物传感器概述

1．2 细胞传感器

2 滚环扩增

2．1 滚环DNA扩增的概念

2．2 滚环DNA扩增的原理

2．3 滚环扩增体系应用研究进展

2．4 滚环扩增的发展前景

3 核酸适体探针检测肿瘤细胞的研究

3．1 核酸适体探针的筛选——SELEX技术

3．2 核酸适体探针在肿瘤诊断和治疗中的应用

4 本论文的研究目的和内容

第二章 滚环复制放大技术在分子逻辑门体系中的应用

1 引言

2 实验部分

2．1 试剂与仪器

2．2 试验方法

3 结果与讨论

3．1 方法的灵敏性——不同浓度Hg2+的测定

3．2 方法的灵敏性——不同浓度Ag+的测定

3．3 金属离子的选择性

3．4 AND逻辑门

3．5 OR、INHIBIT、XOR逻辑门

3．6 NAND、NOR、NXOR逻辑门

4 小结

第三章 滚环复制放大技术在肿瘤细胞检测中的应用

1 引言

2 实验部分

2．1 试剂与仪器

2．2 试验方法

3 结果与讨论

3．1 实验原理

3．2 AuNPs的表征

3．3 luminol-H2O2-HRP-PIP发光体系反应时间的选择

3．4 各组分的紫外可见吸收光谱性质

3．5 方法的灵敏性——不同数量的Ramos细胞的测定

3．6 方法的选择性

4 小结

结论

参考文献

致谢

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