等温双链核酸扩增检测新技术研究

摘要

核酸扩增技术是生化分析检测的热门研究领域，迄今为止已经发展出了众多基于核酸扩增的检测方法。聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)及其衍生技术，需要经过循环的变温过程，对仪器依赖性强，在现场快速检测等领域的应用具有一定的局限性;因此，发展简便快速、灵敏准确的等温核酸扩增技术具有非常重要的意义。本论文中，在以往链置换扩增的基础上，于完全等温条件下建立了一种指数式扩增检测双链核酸的新方法，并对该类型反应所出现的非特异性扩增进行了研究。
　　本论文中，将切刻酶和聚合酶联合使用，在完全等温的条件下建立了一种扩增检测双链核酸的新方法。该方法实现了单链靶标的产生与扩增在封闭体系中及同一温度下进行，不需要额外的预变性等操作步骤，方法简便快速，灵敏准确。应用该方法对pBluescriptⅡ KS(+)质粒（简称为PBS质粒）DNA进行了检测，当目标DNA浓度为1.0 fmol到1.0zmol时，检测结果具有良好的线性关系;并且方法在复杂体系进行检测时，也表现出了较好的稳定性。为了检测该方法的实际应用能力，本论文对副溶血性弧菌进行了检测，结果显示，该方法可以将约100zmol的基因组DNA检测出来，证明了本方法具有一定的实际应用能力。
　　为了进一步提高应用本方法检测副溶血性弧菌的灵敏度，本论文探讨了应用分子信标代替Sybr GreenⅠ进行信号检测的可行性;同时，为了探究该类型反应出现非特异性扩增的原因，本论文对含有切刻酶识别序列的引物所引起的非特异性扩增进行了研究，同时结合前人的研究成果进行了开放性探讨，总结出了一些经验，为进一步的研究提供了基础的资料。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 基于信号放大的核酸分析技术

1．1．1 无工具酶参与的DNA动态扩增技术

1．1．2 工具酶介导的信号放大技术

1．2 分子生物学技术在副溶血性弧菌检验中的应用

1．2．1 副溶血性弧菌及其危害简介

1．2．2 副溶血性弧菌传统检验方法

1．2．3 基于核酸检测副溶血性弧菌的方法

1．3 本论文的研究意义与主要内容

第二章 等温双链核酸扩增检测法的建立及应用

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 仪器与试剂

2．2．2 PBS质粒DNA以及副溶血性弧菌基因组DNA的提取

2．2．3 凝胶电泳确认提取产物和反应原理

2．2．4 实时荧光检测

2．3 结果与讨论

2．3．1 实验设计思路

2．3．2 引物链的设计

2．3．3 电泳表征提取的DNA及反应原理

2．3．4 PBS质粒DNA的检测

2．3．5 对副溶血性弧菌基因组DNA的检测

2．4 小结

第三章 等温双链核酸扩增检测法非特异性反应成因的研究

3．1 引言

3．2 实验方案的改进

3．2．1 分子信标检测方案1

3．2．2 分子信标检测方案2

3．2．3 引物序列及扩增结果

3．3 引物非特异性反应起因的探讨

3．3．1 仪器与试剂

3．3．2 实验操作

3．3．3 引物二级结构模拟及实验结果图

3．3．4 带有酶切位点的引物之间非特异性扩增原因的开放性探讨

3．4 小结

结论

参考文献

附录

致谢

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