花生转录因子AhWRI1基因的克隆与功能研究

摘要

随着世界对植物油需求的不断增加，改良花生种子脂肪酸组成和提高油脂含量成为花生育种工作的重中之重。转录调控因子可带动相关代谢途径中一系列基因的超量表达，能够大大提高油脂水平。本研究从花生品种花育33号叶片中克隆得到两个转录因子：AhWRI1-1和AhWRI1-2，并对基因及其编码蛋白进行生物信息学分析，利用qRT-PCR技术对两基因在植株不同组织、种子不同发育时期、多种逆境胁迫及激素处理下的表达情况进行分析。利用拟南芥原生质体瞬时表达技术确定编码蛋白的亚细胞定位，通过原核表达系统获得目的蛋白。利用农杆菌介导的遗传转化技术获得转基因拟南芥和烟草。 主要研究如下： 1. 从花生品种花育33号叶片中克隆得到AhWRI1-1和AhWRI1-2基因全长cDNA序列。AhWRI1-1基因的ORF为1101bp，编码366个氨基酸；AhWRI1-2基因的ORF为1128bp，编码375个氨基酸。生物信息学分析发现两基因编码的蛋白序列与拟南芥、甘蓝型油菜和大豆中的WRI1蛋白序列相似性皆在60%以上。两基因编码蛋白皆含有2个AP2/EREBP结构域，其中AhWRI1-1蛋白2个AP2保守结构域位于氨基酸序列的第65~137位和第167~231位；AhWRI1-2蛋白2个AP2保守结构域位于氨基酸序列的第77~149位和第179~243位。因此推测两基因可能是AP2家族的转录因子，具有与该家族相同的功能。 2. 利用qRT-PCR技术分别检测了AhWRI1-1和AhWRI1-2基因在植株不同组织、种子不同发育时期、三种非生物胁迫(高盐、低温、干旱)及ABA等激素处理条件下的表达情况。结果发现AhWRI1-1在种子中的表达量最高，AhWRI1-2在下胚轴中的表达量最高。AhWRI1-1基因对三种非生物胁迫均有响应，在高盐、低温胁迫下表达量明显上调，在干旱胁迫下明显下调。AhWRI1-2基因在高盐、低温、干旱非生物胁迫下表达量均有上调。说明这两个基因可能参与了花生对高盐、低温、干旱的抗性调节。并且AhWRI1-2在ABA信号调控途径中为正调控因子，受ABA信号诱导表达。 3. 利用单酵母杂交技术，构建pGBKT7-AhWRI1-1和pGBKT7-AhWRI1-2表达载体，并转入AH109酵母菌株中，发现其能在SD/-Trp/-His二缺培养基中正常 生长，且在进行β-半乳糖苷酶显色实验时呈现蓝色，表明AhWRI1-1和AhWRI1-2具有转录激活活性，属于转录激活子。 4. 将构建好的融合表达载体 pAN580-GFP-AhWRI1-1 ，pAN580-GFP-AhWRI1-2和pAN580-GFP空载体分别转化野生型拟南芥原生质体，利用激光扫描共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白分布于细胞核中，结果表明AhWRI1-1和AhWRI1-2蛋白皆定位于为细胞核。构建pET-28b-AhWRI1-1和pET-28b-AhWRI1-2原核表达载体，通过小试实验确定融合蛋白最佳诱导表达条件为：Rosetta菌株，0.5 mM IPTG，220 rpm，37℃，诱导8 h，并成功诱导了两基因融合蛋白的表达。 5. 构 建 植 物 表 达 载 体 pCAMBIA1300-AhWRI1-1 和 pCAMBIA1300-AhWRI1-2，并转入农杆菌EHA105菌株中，利用农杆菌介导法获得转AhWRI1-2基因拟南芥6株，利用农杆菌介导的植物组织培养方法获得转AhWRI1-2基因烟草6株。对拟南芥T4代种子的油脂含量进行分析，结果显示转AhWRI1-2基因拟南芥种子油脂含量与野生型相比提高了94.90％，表明AhWRI1-2对转基因拟南芥中种子油脂含量的提高有促进作用。

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第一章 引言

1.1 植物油供求现状及意义

1.2 植物油脂合成途径

1.3 植物油合成相关转录因子研究进展

1.3.1 油脂积累相关B3家族转录因子

1.3.2 油脂积累相关HAP3家族转录因子

1.3.3 其他油脂积累相关的转录调控因子

1.4 AP2/EREBP转录因子超家族

1.5 转录因子WRI1的研究进展

1.5.1 转录因子WRI1的发现及结构

1.5.2 转录因子WRI1的功能分析

1.6 酵母单杂交技术

1.7 研究目的和意义

第二章 AhWRI1-1和AhWRI1-2基因的表达特异性研究

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 主要试剂及仪器

2.2 实验方法

2.2.1 非生物逆境胁迫和激素处理方法

2.2.2 基因的克隆

2.3 结果与分析

2.3.1 基因的克隆

2.3.2 基因的生物信息学分析

2.3.3 基因表达特性分析

2.3.4 转录激活活性分析

2.4 讨论

第三章 亚细胞定位及重组蛋白的表达

3.1 实验材料

3.1.1 主要酶、菌种及质粒

3.1.2 主要试剂与仪器

3.2 实验方法

3.2.1 亚细胞定位分析

3.2.2 目的蛋白的原核表达

3.2.3 SDS-PAGE电泳检测方法

3.3 结果与分析

3.3.1 拟南芥原生质体中两基因的亚细胞定位

3.3.2 目的蛋白的原核表达

3.4 讨论

第四章 拟南芥及烟草的遗传转化

4.1 实验材料

4.1.1 植物材料

4.1.2 主要试剂及仪器

4.2 实验方法

4.2.1 植物叶片基因组DNA快速提取方法

4.2.2 植物表达载体构建

4.2.3 农杆菌感受态的制备

4.2.4 拟南芥的遗传转化

4.2.5 烟草的遗传转化

4.2.6 转基因植株种子油脂含量分析

4.3 结果与分析

4.3.1 转基因拟南芥的分子生物学检测

4.3.2 转基因拟南芥的遗传稳定性分析

4.3.3 转基因烟草的分子生物学检测

4.3.4 转基因植株种子含油量分析

4.4 讨论

结 论

参考文献

致 谢

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