多功能纳米探针的构建及细胞内活性物质的检测

摘要

继艾滋病之后，癌症成为世界范围内又一大公共健康问题。根据美国国家卫生统计中心收集的癌症死亡率数据，2019年预计约有170万份癌症诊断记录和600000例癌症死亡病例，恶性癌症死亡率占公民死因的23.91%。因此早期癌症的确诊和干预已成为降低癌症死亡率的主要任务。本文基于生物相容性纳米贵金属材料结合荧光共振能量转移与表面增强拉曼散射，实现了肿瘤标志物端粒酶、miRNAs和MUC1蛋白的检测。本文主要包括以下三个部分： （1）第一章基于荧光共振能量转移（FRET）和表面增强拉曼（SERS）技术构建了一种新型的“跷跷板”式比率探针（SR），实现了在单个活细胞内端粒酶成像和检测。当SR探针利用细胞膜的胞吞作用进入MCF-7细胞时，Rox分子接近AuNPs，Cy3分子远离AuNPs,Rox的荧光被淬灭，出现拉曼信号，Cy3的荧光恢复，拉曼信号消失。当存在端粒酶和dNTPs时，由引物链产生端粒酶重复序列(TTAGGG)n引发竞争性杂交反应。SR探针的结构解离，发夹DNA H2被释放，H1的发夹结构恢复。由于Rox，Cy3和AuNPs之间距离的改变，Rox分子远离AuNPs，而Cy3分子靠近AuNPs，由于FRET现象，Cy3的荧光淬灭，出现拉曼信号，Rox的荧光恢复，拉曼信号消失。SR探针的动态变化由荧光成像来检测，而用双信号拉曼强度的比值来定量检测端粒酶的活性。 （2）第二章设计了一种双标记纳米探针（DL），实现了细胞膜上的MUC1蛋白和细胞内的miRNA-21的识别。当双标记纳米探针与细胞膜接触时，MCF-7细胞膜上过度表达的MUC1蛋白会与探针上的适体链H2结合，H2链从双标记纳米探针上解离出来，H2链上修饰的Rox分子与AuNPs之间的距离增大，Rox的拉曼信号消失，荧光信号恢复，细胞膜上出现Rox的荧光信号（蓝色）。H2链与在细胞膜表面上的MUC1蛋白结合后，DNA H1的发夹结构恢复，Cy3分子与AuNPs的距离减小，出现Cy3的拉曼信号，并且荧光信号被淬灭。当细胞内miRNA-21出现时，miRNA-21将DNA H1发夹结构打开，导致Cy3的拉曼信号消失，荧光信号恢复，Cy3（红色）的荧光信号出现在细胞质内。 （3）第三章设计了或门（OR），与门（AND）两种DNA逻辑门，同时制备了有Rox拉曼信号的探针，将无酶放大策略的杂交链式反应（HCR）和表面增强拉曼散射技术（SERS）用于构建目标miRNA响应的SERS逻辑门。通过目标miRNA识别OR逻辑门的发夹DNA H1，H2和S1链将HCR反应的立足点暴露出来，并与另外六种发夹DNA H3和H4，H5和H6，S2和S3反应，引发杂交链式反应，形成长的双链DNA，进一步将标记有Rox的拉曼探针加入反应体系，与形成的双链DNA结合实现对目标miRNA的检测。

目录

第一章 前言

1.1 肿瘤及肿瘤标志物

1.1.1 世界肿瘤近况

1.1.2癌症生物标志物

1.1.3常见的癌症生物标志物检测

1.2 表面增强拉曼散射

1.2.1 表面增强拉曼散射简介

1.2.2 表面增强拉曼散射应用

1.3 端粒酶

1.3.1 端粒酶简介

1.3.2 端粒酶活性体外检测方法

1.3.3 端粒酶细胞成像分析方法

1.3.4 细胞内端粒酶成像与治疗

1.4 逻辑门

1.4.1 生物逻辑门简介

1.4.2 核酸逻辑门分类

1.4.3 核酸逻辑门应用

1.5 本工作的意义及研究内容

第二章 单细胞内端粒酶活性的双光谱检测与成像

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 实验试剂

2.2.2 实验仪器

2.2.3 金纳米粒子的合成

2.2.4“跷跷板”式比率（SR）探针的制备

2.2.5 SR探针的电泳分析

2.2.6 SR探针与端粒酶作用的SERS表征

2.2.7 MCF-7细胞培养

2.2.8细胞摄取SR探针

2.2.9 MCF-7细胞的荧光成像

2.2.10 MCF-7细胞的拉曼成像

2.3 结果与讨论

2.3.1 实验原理

2.3.2 SR探针TEM和UV表征

2.3.3可行性研究

2.3.4实验条件的优化

2.3.5特异性研究

2.3.6端粒酶的SERS检测

2.3.8端粒酶在MCF-7细胞中的SERS成像

2.3.9活细胞端粒酶检测评价

2.3.10活细胞内SR探针的稳定性

2.3.11活细胞内SR探针的毒性研究

2.4 小结

第三章 细胞MUC1蛋白和miRNA的同时检测与成像分析

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 实验试剂与仪器

3.2.2 金纳米粒子的合成

3.2.3 双标记纳米探针（DL）的制备

3.2.4 MCF-7细胞培养

3.2.5 HepG2细胞培养

3.2.6 细胞摄取双标记纳米探针（DL）

3.2.7 MCF-7/HepG2细胞的荧光成像

3.3 结果与讨论

3.3.1 实验原理

3.3.2 双标记探针的TEM和UV表征

3.3.3 实验可行性研究

3.3.4 实验条件优化

3.3.5 实验特异性研究

3.3.6 MCF -7细胞中 MUC1 与 miRNA-21 的荧光成像

3.4 小结

第四章 基于多重miRNA响应的SERS逻辑门的构建

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1实验试剂与仪器

4.2.2金纳米粒子的合成

4.2.3反应缓冲溶液的制备

4.2.4 Rox拉曼探针制备

4.2.5 磁性微球（MB）的活化

4.2.6OR逻辑门发夹DNA H1/H2在磁性微球上的固定

4.2.7 OR逻辑门HCR放大反应

4.2.8AND逻辑门发夹DNA S1在磁性微球上的固定

4.2.9 AND逻辑门HCR放大反应

4.2.10 OR/AND逻辑门SERS检测

4.3 结果与讨论

4.3.1 实验原理

4.3.2 Rox探针的TEM和UV表征

4.3.3 实验条件优化

4.3.4 发夹DNA茎部互补碱基数优化

4.3.5 发夹DNA浓度优化

4.3.6 OR逻辑门设计与操作

4.3.7 AND逻辑门设计与操作

4.4 小结

结论

参考文献

致谢

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