腺相关病毒载体AAV-hVEGF的构建及hVEGF与TGFβ1对椎间盘纤维环细胞的生物学效应

摘要

目的：构建人血管内皮生长因子(humanvascularendothelialgrowthfactor，hVEGF165)腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)载体AAV-hVEGF165，并体外检测其在椎间盘纤维环细胞中的表达，以及观察AAV-hVEGF165与AAV-TGFβ1(transforminggrowthfactorbeta1，TGFβ1)基因联合转染对纤维环细胞Ⅰ型胶原的生物学效应。探讨应用hVEGF165基因逆转椎间盘退变可行性。　　方法：采用分子克隆技术，从pcDNA3(+)-hVEGF165质粒获得hVEGF165cDNA，并克隆至AAV包装质粒pSNAV上，构建成pSNAV-hVEGF165的AAV重组质粒，经酶切及测序鉴定正确，用脂质体介导pSNAV-hVEGF165转染HEK293细胞和血管内皮细胞(VEC)，荧光免疫组化方法检测hVEGF165蛋白，并用MTT法测定hVEGF165对VEC增殖的影响。由本元正阳公司对鉴定正确的pSNAV-hVEGF165进行AAV-hVEGF165的包装。AAV-hVEGF165与AAV-TGFβ1联合转染原代培养的椎间盘纤维环细胞，Westernblotting检测hVEGF165与TGFβ1的表达以及纤维环细胞Ⅰ型胶原表达量的变化。　　结论：构建的腺相关病毒载体AAV-hVEGF165可在体外表达，hVEGF165在体外能够协同TGFβ1促进纤维环细胞Ⅰ型胶原表达的增加，hVEGF165有可能基因逆转椎间盘的早期退变。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分AAV-hVEGF165的构建

材料和方法

一、材料

二、方法

结果

10.1hVEGF165PCR扩增产物

10.2质粒pSNAV的酶切鉴定

10.3pSNAV-VEGF165构建及鉴定

10.4HEK293细胞的培养

10.5脂质体介导pSNAV-hVEGF165转染后的HEK293细胞

10.6pSNAV-hVEGF165的免疫荧光组化

10.7VEC的培养

10.8MTT法测定hVEGF165蛋白活性

10.9AAV-hVEGF165的包装结果

第二部分hVEGF165与TGF β1对椎间盘纤维环细胞的生物学效应

材料和方法

一、材料

二、方法

结果

7.1兔椎间盘纤维环细胞的培养

7.2ABC免疫组织化学鉴定兔椎间盘纤维环细胞

7.3rAAV-EGFP转染兔纤维环细胞

7.4rAAV-hVEGF165转染兔纤维环细胞及hVEGF165表达的Westernblotting鉴定

7.5rAAV-TGFβ1转染兔纤维环细胞及TGFβ1表达的Westernblotting鉴定

7.6rAAV-hVEGF165、rAAV-TGFβ1转染兔纤维环细胞及其Ⅰ型胶原表达量的Westernblotting检测

讨论

小结

参考文献

综述 血管内皮生长因子与椎间盘退变

参考文献

攻读学位期间的研究成果

附录

致谢

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