腺相关病毒介导的OP-1和hVEGF基因转染阻逆羊退变椎间盘的生物学效应

摘要

目的：
　　通过纤维环16G针头穿刺的方法建立一种羊椎间盘缓慢退行性变动物模型;观察腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体能否在山羊退变椎间盘体内安全有效的表达;观察腺相关病毒介导的成骨蛋白-1(osteogenic protein，OP-1)基因体内转染羊退行性变椎间盘的细胞后有效持续表达对退变椎间盘的修复效果;观察腺相关病毒介导的人血管内皮生长因子基因体内转染能否有效持续表达并促进退变椎间盘修复;观察腺相关病毒介导的OP-1基因联合hVEGF基因体内转染羊退行性变椎间盘的细胞后能否有效的持续表达，并对退变椎间盘的产生更佳的修复效果。
　　方法：
　　1.动物分组:88只清洁级山羊(specific pathogen free，SPF)，抽取4只作为备用动物为H组;A组，8只动物为AAV-OP-1注射组;B组，8只动物为AAV-VEGF注射组;C组，8只动物为AAV-OP-1联合AAV-VEGF注射组;D组，8动物为磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）注射组（安慰剂，对照组）;E组，4只动物为AAV-EGFP注射;F组，8动物为单纯针刺造模组;G组为剩余的8只动物，也做手术，但不损伤椎间盘。即G组和H组的动物椎间盘是完整的。
　　2.制作纤维环针刺动物模型。排除G组和H组，将剩余的76只动物来做退变动物模型。在全麻下，采取侧俯卧位，经腹膜外入路显露椎间盘，任意选相连的3个椎间盘，用16G针头穿刺纤维环，穿刺点位于纤维环中央偏左侧平行于下位椎体的上终板并控制其深度为10mm、旋转180度。用黑色缝在相应椎间盘的横突作标记。
　　3.动物体内椎间盘基因转染（A、B、C、D、E组）。时间为造模后第4周（28天）。采用相同的手术入路。A组动物造模间盘用27G针头的显微注射器各注射50ulAAV-OP-1(1×1012vg/L);B组动物造模间盘注射50ul AAV2-VEGF(1×1012vg/L);C组造模问盘各注射50ul AAV-OP-1和AAV-VEGF(1×1012vg/L);D组造模间盘各注射50ul PBS;E组造模间盘各注射50 ulAAV-EGFP(1×1012vg/L)。造模后6周(42d)、8周(56d)、12周(84d)、16周(102d)，OP-1、VEGF、双基因联合、空白对照组每组分别杀死4只动物，F、G组每组分别杀死2只动物，取得造模间盘;造模后16周处死E组4只羊，收获椎间盘组织。
　　4.影像学观察，分别于0周、4周(28d)、6周(42d)、8周(56d)、12周(84d)、16周(102d)拍摄腰椎正侧位DR平片，应用PACS系统做数据统计与分析。
　　5.组织学观察，采用HE染色、Safranine O染色、Masson染色、免疫组化等方法，定性、定量观察椎间盘退行性变的发展变化。
　　6.生物化学检测，采用免疫荧光、免疫印迹Western-Blot法检测等定性、定量观察基因表达的生物学效应。
　　7.统计数据。采用SPSS17.0进行统计学分析，单因素方差分析，数据以±SD表示，p＜0.01认为差异有显著统计学意义，p＜0.05认为差异有统计学意义。
　　结果
　　1.影像学分析结果:OP-1组动物的造模椎间盘高度大于空白对照组，其％DHI与空白对照组有明显差异(P＜0.05)，双基因联合组的造模椎间盘高度恢复的最佳，其％DHI与空白对照组有显著差异(P＜0.05)，VEGF组和F组动物的造模椎间盘高度均持续下降，与空白对照组数据相似，其％ DHI与空白对照组数据分析，均无明显统计学意义(P＞0.05)。
　　2.Ⅱ型胶原免疫组化染色:OP-1组动物的造模椎间盘髓核内的Ⅱ型胶原含量在造模6周、8周、12周、16周时高均于空白对照组、F组，在16周时差异最显著，其Ⅱ型胶原免疫组化染色的平均光密度值与空白对照组有明显差异(P＜0.05)，OP-1能在动物体内促进Ⅱ型胶原合成代谢。VEGF组与D、F组动物造模椎间盘髓核Ⅱ型胶原含量在各个时期无显著性差异，VEGF组和F组动物的造模椎间盘Ⅱ型胶原均持续下降，与空白对照组数据相似，其Ⅱ型胶原免疫组化染色的平均光密度值与空白对照组数据分析，均无明显统计学意义(P＞0.05)。双基因联合组动物的造模椎间盘髓核内的Ⅱ型胶原含量在造模6周、8周、12周、16周时高均于空白对照组、F组，在12和16周时差异最显著，其Ⅱ型胶原免疫组化染色的平均光密度值与空白对照组有显著差异(P＜0.01)，OP-1与VEGF双基因能显著提高动物体内Ⅱ型胶原的合成代谢。
　　3.Ⅰ型胶原免疫组化染色:OP-1组动物的造模椎间盘髓核内的Ⅰ型胶原含量在造模6周、8周、12周、16周时高均于空白对照组、F组，在16周时差异最显著，其Ⅰ型胶原免疫组化染色的平均光密度值与空白对照组有明显差异(P＜0.05)，OP-1能在动物体内促进Ⅰ型胶原合成代谢。VEGF组与D、F组动物造模椎间盘髓核Ⅰ型胶原含量在各个时期无显著性差异，VEGF组和F组动物的造模椎间盘Ⅰ型胶原均持续下降，与空白对照组数据相似，其Ⅰ型胶原免疫组化染色的平均光密度值与空白对照组数据分析，均无明显统计学意义(P＞0.05)。双基因联合组动物的造模椎间盘髓核内的Ⅰ型胶原含量在造模6周、8周、12周、16周时高均于空白对照组、F组，在16周时差异最显著，其Ⅰ型胶原免疫组化染色的平均光密度值与空白对照组有显著差异(P＜0.01)，OP-1与VEGF双基因能显著提高动物体内Ⅰ型胶原的合成代谢。
　　4.35S测定蛋白多糖合成率:OP-1组动物的造模椎间盘髓核内的蛋白多糖含量在造模6周、8周、12周、16周时高均于空白对照组、F组，在16周时差异最显著，其35S蛋白多糖合成率与空白对照组有明显差异(P＜0.05)，OP-1能在动物体内促进蛋白多糖的合成代谢。VEGF组与D、F组动物髓核蛋白多糖含量在各个时期无显著性差异，VEGF组和F组动物的造模椎间盘蛋白多糖含量均持续下降，与空白对照组数据相似，其35S蛋白多糖合成率与空白对照组数据分析，均无明显统计学意义(P＞0.05)。双基因联合组动物的造模椎间盘髓核内的蛋白多糖含量在造模6周、8周、12周、16周时高均于空白对照组、F组，在12和16周时差异最显著，其35S蛋白多糖合成率与空白对照组有显著差异(P＜0.01)，OP-1与VEGF双基因能显著提高动物体内蛋白多糖的合成代谢。
　　5.Western Blot法检测Ⅱ型胶原:OP-1组动物的造模椎间盘髓核内的Ⅱ型胶原含量在造模6周、8周、12周、16周时高均于空白对照组、F组，在16周时差异最显著，其Ⅱ型胶原蛋白灰度值与空白对照组有明显差异(P＜0.05)，OP-1能在动物体内促进Ⅱ型胶原合成代谢。VEGF组与D、F组动物造模椎间盘髓核Ⅱ型胶原含量在各个时期无显著性差异，VEGF组和F组动物的造模椎间盘Ⅱ型胶原均持续下降，与空白对照组数据相似，其Ⅱ型胶原蛋白灰度值与空白对照组数据分析，均无明显统计学意义(P＞0.05)。双基因联合组动物的造模椎间盘髓核内的Ⅱ型胶原含量在造模6周、8周、12周、16周时高均于空白对照组、F组，在12和16周时差异最显著，其Ⅱ型胶原蛋白灰度值与空白对照组有显著差异(P＜0.01)，OP-1与VEGF双基因能显著提高动物体内Ⅱ型胶原的合成代谢。
　　6.免疫荧光:E组动物在造模椎间盘16周后仍有效表达EGFP。
　　结论：
　　1.AAV-OP-1和AAV-hVEGF体内转染后可持续表达12周;
　　2.AAV-OP-1转染退变椎间盘可延缓其退变速度;
　　3.AAV-OP-1和AAV-hVEGF有协同效应，双基因联合能更加有效地延缓椎间盘退行性变。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 腰椎间盘退行性变的生物学治疗概述

第二章 腺相关病毒介导的OP-1和hVEGF基因转染阻逆羊退变椎间盘的生物学效应

1．造模材料

2 实验方法

结果

讨论

结论

附表附图

参考文献

致谢

攻读博士学位期间已发表及待发表的论文

英文论文一

英文论文二