蛋白质组学和分子生物学在HCMV感染致病机制的应用研究

摘要

目的: 1.应用SELDI-TOF-MS技术检测人巨细胞病毒(HCMV)感染导致临床个体致肝炎综合征血清学和HCMV感染相关细胞的神经瘤细胞内、外液蛋白质组学差异表达，建立与HCMV致病相关的蛋白标志物筛选方法； 2.建立可调控的针对HCMV即刻早期基因的细胞表达系统，并检测即刻早期基因对细胞抗凋亡的影响，以此探讨可能的机理。 材料和方法： 1.取临床HCMV引起的先天性婴儿肝炎综合征(Congenital human cytomegalovirus hepatitis)患儿20例作为实验组，三个对照组25例血清标本(肝功能情况检测、CMV特异性IgM抗体及尿CMV基因定量检测)，分离并制备蛋白，与WCX2蛋白质芯片相互作用，利用SEIDI-TOF-MS技术检测细胞内液中分子量在5000-20000Da范围内蛋白质的表达情况，绘制出蛋白飞行质谱，在Biomarker Wizard软件的辅助下，分析差异蛋白。根据蛋白质的分子量和等电点，在Swiss蛋白数据库中对差异蛋白进行初步鉴定。 2.选择人星型胶质瘤细胞(U251细胞)和人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)，按细胞数量之比为10:1的比例将两种细胞混合培养，感染HCMVAD169株。病毒感染神经瘤细胞6h后，RT-PCR的方法检测HCMV IE基因的表达水平。流式细胞仪检测，观察HCMV感染对神经瘤细胞凋亡的影响；体外培养U251，细胞，细胞感染病毒后不同时间段收获细胞为实验组，同时收获正常细胞为对照组，使用基于SELDI技术的时间.飞行质谱仪和WCX2芯片，检测各组之间细胞内、外液蛋白表达谱的差异。将各组蛋白质图谱进行比较，并将相关蛋白峰在Swiss蛋白数据库中检索，寻找与病毒的感染及发病相关的蛋白分子。 3.利用已有质粒pIE72，设计人巨细胞病毒HCMV即刻早期基因IE1的特异性引物，进行IE1基因的扩增、提纯、鉴定，构建重组的可调控真核表达载体pTRE2-hyg/IE1，纯化质粒。 4.常规培养Tet-On HeLa细胞，以阳离子高效转染试剂HifectinⅡ转染细胞。首先在培养的HeLa细胞中转染增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)报道基因，在普通荧光显微镜下观察显示绿色荧光的HeLa细胞，确定转染效率；在转染EGFP基因的基础上，体外常规培养Tet-On HeLa细胞，转染pTRE2-hyg/IE1重组质粒，经G418和潮霉素双重筛选，RT-PCR和Western Blot和免疫组织化学方法鉴定IE1的表达。 5.终浓度为100ng/mL的肿瘤坏死因子a作用于HeLa细胞，建立HeLa细胞的凋亡曲线；不同终浓度的Doxcycline(0.1μg/mL、1μg/mL和10μg/mL)作用转染pTRE2-hyg/IE1的HeLa细胞，诱导IE1表达，RT-PCR方法检测IE1基因的产生，Western blot检测IE1蛋白的产生水平，MTT法检测HeLa细胞的细胞增值率。 结果： 1.HCMV引起的先天性婴儿肝炎综合征组与各对照组比较，血清中有4个蛋白质表达水平发生明显变化，在Swiss蛋白数据库中检索到分子量为5811.6Da、7935.6Da和8899.3Da的蛋白峰分别与β-防御素8、巨噬细胞源性趋化因子和血小板碱性蛋白在分子量和等电点上非常接近。 2.HCMV感染的两个组与无HCMV感染的两组婴儿比较，血清中共有5个蛋自质表达水平发生明显变化，其中5639.0Da、5909.6Da、7776.5Da和15833.2Da的蛋白峰分别与促胸腺生成素、β淀粉样前体蛋白A4、血小板因子4和白细胞介素-25在分子量和等电点上非常接近。 3.HCMV隐性感染组与其他组比较，血清中有2个蛋白质表达水平发生明显变化，5710.7Da的蛋自峰与β-防御素31非常接近。 4.两个先天性婴儿肝炎综合征组与肝功能正常的另两组婴儿比较，血清中有4个蛋白质表达水平发生明显变化，其中7567.6Da、13744.1Da、15092.8Da、15931.6Da的蛋白峰分别与巨噬细胞炎性蛋白4、前白蛋白、肝再生增强因子和结合珠蛋白非常接近。 5.RT-PCR的方法检测HCMV IE基因的表达用于证实HCMV感染，成功建立了神经瘤细胞的HCMV感染模型。病毒感染1天后细胞无明显变化，感染3天后细胞在G1峰左侧出现一个亚二倍体细胞群的峰(亚G1峰，即凋亡峰)，感染5天后细胞凋亡峰明显。 6.病毒感染后细胞发生凋亡，且随病毒感染时间的延长，细胞凋亡明显增加。感染后3天和6天的细胞凋亡率分别为4.1％和42.6％。与正常对照组比较，分子量为2631.6Da、12027Da和13536.3Da的蛋白峰在病毒感染后表达持续上调，HCMV感染后4h略有增高，病毒感染后48h明显升高。通过在Swiss数据库中检索发现其蛋白峰的分子量和等电点分别与Caspase-1、TNF-a、β淀粉样前体蛋白非常接近。 7.构建的真核表达载体pTRE2-hyg/IE1序列测定正确。Dox调控的重组表达载体pTRE2-hyg/IE1体外转染HeLa细胞后，经G418和潮霉素B双重筛选，获得一株稳定表达IE1的HeLa细胞株。梯度浓度的Doxcycline(0.1μg/mL、1μg/mL和10μg/mL)作用pTRE2-hyg/IE1-HeLa细胞48h，RT-PCR检测Dox诱导表达的mRNA比值IE1/β-actin分别为0.733，0.917和1.768，western blot检测IE1蛋白，IE1/β-actin分别为1.32，5.83和7.07。 8.终浓度为100μg/mL的TNF-a和25μg/mL的ACTD联合作用于转染IE1质粒的HeLa细胞后，MTT检测HeLa细胞增值率显示转染IE1的细胞在8h之内细胞活性大于未转染细胞组，caspACE检测caspase-3表达量分别为0.6±0.029、1.6±0.04.1和1.85±0.065，而未转染IE1的HeLa细胞caspase-3表达量分别为0.85±0.061、2.6±0.058和4.5±0.065。统计学分析各组比值差异有显著意义(P<0.01)，从而证明转染后的IE1-HeLa细胞具有显著抗凋亡功能，细胞学观察也证实这一点。 结论： 1.建立了HCMV感染引起的先天性婴儿肝炎综合征人群的血清蛋白质组学数据库和HCMV感染神经瘤细胞的细胞内、外液差异蛋白质组学数据库，并发现了HCMV临床个体及细胞学改变的有意义的蛋白质组学指标。 2.HCMV感染过程持续增高的细胞蛋自因子，可能与HCMV感染所产生的细胞凋亡有关。 3.可调控表达外源基因的Tet-On质粒，可以在Dox诱导下，表达与Dox剂量依赖的外源插入基因编码蛋白HCMV IE1，可抑制细胞凋亡。

目录

声明

摘要

第一章：HCMV感染致婴儿肝炎综合征的血清蛋白质组学差异谱研究

摘要

一、前言

二、材料与方法

三、结果

讨论

小结

参考文献

第二章：运用SELDI蛋白质芯片技术检测神经胶质瘤细胞感染HCMV后蛋白质的差异表达

摘要

前言

1材料和方法

2结果

3讨论

小结

参考文献

第三章：HCMVIE1可调控表达载体构建以及IE1蛋白抑制HeLa细胞凋亡机制初步探讨

摘要

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

小结

参考文献

综述一：HCMV感染致细胞病变及其即刻早期蛋白的研究进展

综述二：蛋白质组学和SELDI-TOF-MS技术在病毒感染方面的研究进展

博士研究生在读期间的学术成果

致谢