RNAi对晶体上皮细胞炎症损伤模型中IKK-α及下游因子的抑制作用的研究

摘要

目的：通过建立肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的人晶体上皮细胞(HLE-B 3)炎症损伤模型，观察炎症损伤后细胞性状的改变，研究核因子-kB(NF-κ B)上游抑制因子I kB的激酶-α亚单位(IKK-α)在炎症损伤中的表达变化及作用。利用RNA干扰(RNAi)技术，探讨人品状体上皮细胞中激酶IKK α亚单位小干扰RNA(siRNA)转染HLE-B3细胞后对炎症损伤诱导的IKK-α及下游因子表达的抑制作用。 方法：1.将人重组TNF-α加入HLE-B3细胞的培养液中，使终浓度为20ng/ml，分别孵育6h、12h、24h及48h以制备HLE-B3细胞的炎症损伤模型。倒置显微镜下观察细胞性状的变化，采用免疫组织化学和实时荧光定量PCR的方法，分别检测IKK-α蛋白及其mRNA的表达变化。2.采用荧光标记siRNA与转染试剂HiperFect2000的不同浓度组合，分别转染HLE-B3细胞，12h后在荧光倒置显微镜下观察转染效率，，MTT法检测转染复合物的毒性，对转染条件进行优化。3.设计并体外转录合成3条人IKK-αsiRNA，分别转染HLE-B3细胞，通过实时荧光定量PCR的方法检测IKK-αmRNA的表达变化，筛选出抑制效率最高的siRNA。4.采用筛选出的siRNA与优化后的转染条件对HLE-B3细胞进行转染，24h后加入TNF-α进行诱导，并分别于诱导后不同时间收集细胞及培养液，实时荧光定量PCR法检测IKK-αmRNA的表达，ELISA法检测培养液中IKK-α蛋白及下游相关因子IL-1β和TGF-β的含量。 结果：1.TNF-α刺激后HLE-B3细胞胞体伸长变细，细胞形态类似成纤维细胞，细胞间“拉网现象”消失。免疫组化染色显示：正常HLE-B3细胞胞浆中即可见少量IKK-α蛋白的表达，TNF-α刺激后12h，IKK-α蛋白阳性表达量增多，且胞核染色阳性，刺激后24h、48h IKK-α蛋白表达进一步增多，染色由黄色至棕黄色。定量PCR结果显示：与正常对照组比较，TNF-α刺激后6h IKK-αmRNA表达量明显增高，刺激后24h比12h时IKK-α表达量进一步增高，其中受刺激24h后IKK-αmRNA表达量达高峰。2.实验结果显示：增加siRNA的量可以提高转染效率，但siRNA的量为10nM和25nM时转染效率无明显差异。HiPerFect 2000的剂量≤3.0μl时转染复合物的细胞毒性较小，细胞存活率可达80％以上，但是当HiPerFect 2000的剂量增加至5.0μl时，其细胞毒性显著增加。在转染混合物的组成为10nM siRNA与3.0μlHiPerFect 2000时转染效率最高达70.6％，并且仍能保证80％的细胞存活率。3.实时荧光定量PCR证实：设计并体外转录合成的3条IKK-αsiRNA转染HLE-B3细胞后，有2条能够使细胞IKK-αmRNA的表达明显减少，并且其中1条的抑制作用可以达到82％。4.定量PCR结果显示：与正常组比较，转染24h后(即加入TNF-α前)，siRNA组与TNF+siRNA组IKK-αmRNA的表达明显减少，加入TNF-α后TNF组IKK-αmRNA明显增加，TNF+siRNA组虽有增加但仍低于正常细胞水平。双抗体央心法ELISA结果显示：各实验组的细胞培养液中IKK-α蛋白、IL-1β、TGF-β的含量变化规律与IKK-αmRNA的变化规律相一致。 结论：1.应用rhTNF-α进行刺激是建立HLE-B3细胞炎症损伤模型的有效方法。2.HLE-B3细胞炎症损伤模型中IKK-α被活化并表达增加，且该因子于胞浆、胞核中表达均呈阳性，IKK-α可能是外伤障中开启炎症损伤的关键因子。3.经过转染条件的优化，转染试剂HiperFect 2000能将siRNA高效的转染进HLE-B3细胞。4.自行设计合成的IKK-αsiRNA转染进细胞后可以有效地实现对相应的内源性RNA的降解。5.利用RNA干扰(RNAi)的方法可以有效的抑制TNF-α诱导的HLE-B3细胞内IKK-α及下游因子IL-1β、TGF-β的表达上调，从而抑制对HLE-B3细胞的损伤作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一部分TNF-α诱导的HLE-B3细胞炎症损伤模型中IKK-α的表达

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第二部分HiPerFect2000介导的HLE-B3细胞siRNA转染条件的优化

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第三部分人IKK-α siRNA的设计、合成及筛选

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第四部分RNAi对HLE-B3细胞炎症损伤模型中IKK-α mRNA及下游因子表达的抑制作用的研究

1.材料

2.方法

3.结果

4、讨论

结论

参考文献

附图

针对外伤性白内障发病过程中NF-κB信号通路基因治疗的实验研究进展

致谢

攻读学位期间的研究成果