荧光假单胞菌GcM5-1A鞭毛蛋白对黑松的作用机理及蛋白酶抑制剂防治松褐天牛的应用研究

摘要

采用细胞免疫荧光分析、细胞染色观察、电导率测定以及基因组DNA电泳分析技术，对松材线虫携带的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens GcM5-1A）分泌的鞭毛蛋白对黑松愈伤组织细胞的作用及其致死方式进行研究。结果表明，鞭毛蛋白与黑松（Pinus thunbergii）细胞之间存在直接的相互作用；鞭毛蛋白处理的细胞，细胞膜皱缩变形、细胞质浓缩、细胞核解体，形成若干小核，细胞质中的RNA降解；处理细胞的着色力增强，细胞培养液的电导率增加，说明鞭毛蛋白可增加处理细胞的细胞膜透性；基因组DNA的电泳分析证实，处理细胞的DNA发生了断裂，但无明显的梯子形成，推测鞭毛蛋白对黑松细胞的致死方式为非典型的细胞凋亡。
　　 为进一步验证鞭毛蛋白的毒性，本实验构建了组成分泌表达载体pUC18ompA，将荧光假单胞菌Pf-5鞭毛蛋白的编码基因fliC克隆到pUC18ompA构建pUC18ompA-fliC，重组质粒转化E.coli BL21(DE3)构建了工程菌。工程菌与无菌松材线虫混合接种黑松无菌苗，研究其对无菌苗的致病能力。接种试验结果表明，工程菌与无菌松材线虫混合接种同样可以引起黑松无菌苗的萎蔫。进一步验证了体内荧光假单胞菌鞭毛蛋白在松萎蔫病致病过程中的作用。
　　 本研究还对松萎蔫病的防治做了初步探讨。从沙蚕(Perinereis aibuhitensisGrube)的cDNA文库中筛选并鉴定了一半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPI)基因。氨基酸序列分析结果显示，该基因编码蛋白与斑马鱼(Danio rerio)Zgc:153129，水蛭cystatin B以及人ChainA，stefin B四聚体的同源性分别为51％，48％和48％。CPI基因克隆到胞内表达载体pET-15b，并在大肠杆菌中表达。经Ni+亲和层析和DEAE-Sepharose FF离子交换层析纯化重组CPI(PA-CPI)。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析推测，PA-CPI相对分子量为16KDa。活性分析显示，重组蛋白能够抑制木瓜蛋白酶的蛋白水解活性。将CPI编码基因亚克隆到组成分泌表达载体并进行胞外表达。Western-blotting分析结果显示，PA-CPI能够分泌到培养基中。生测结果表明，携带pUC18ompAcat-CPI质粒的E.coli DH5a对松褐天牛（Monochamusalternatus）和光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)的致死率与未转化的E.coliDH5α和培养基对照相比均具有显著性差异。