荧光假单胞菌鞭毛蛋白对黑松细胞作用的转录组分析及黑松银松素合酶基因的克隆与表达

摘要

松材线虫携带的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens GcM5-1A）的鞭毛蛋白会引起黑松(Pinus thunbergii)细胞非典型性凋亡，为了从mRNA水平研究鞭毛蛋白对于黑松细胞的影响机制，本文使用鞭毛蛋白及去离子水分别处理黑松愈伤组织，通过Illumina solexa测序技术对两组样本进行转录组分析，进一步利用RT-PCR技术克隆从黑松体内获得的经转录组分析得出的与银松素合成酶mRNA高相似度的序列，并进行表达纯化。结果表明:通过将转录组数据与GO数据库进行功能比对，共有29，475个转录本比对到功能分支上，这些功能包括生物学过程、细胞组分和分子功能。通过对两样本进行转录组差异表达水平分析，得到差异表达显著的转录本1779个，并对其进行进一步GO分类和KEGG分析，共富集到286个GO功能分支以及11个代谢途径上。通过对转录组数据的上述分析，发现在黑松体内存在的一些与抗病有关的基因在鞭毛蛋白的作用下显著上调，包括以下基因编码的酶，如蔗糖合酶、银松素合酶、几丁质酶、α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂、苯丙氨酸氨裂解酶、4-香豆酸辅酶A连接酶、过氧化物酶、WRKY1、PR5和PR10等。通过RT-PCR技术从黑松体内克隆获得了银松素合成酶cDNA，将此序列克隆到表达载体pET-15b上，构建pET-15b-PLS表达载体，转化E.coli BL21(DE3)构建工程菌，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，重组银松素合成酶在工程菌中得到高效表达，通过Ni2+螯合柱亲和层析得到纯化重组蛋白。本课题从转录组水平研究了荧光假单胞菌鞭毛蛋白对于黑松细胞的作用机制，并鉴定出黑松体内对鞭毛蛋白敏感的基因，为研究鞭毛蛋白对黑松的致病机理创造条件，纯化蛋白的获得将为该蛋白功能的研究及松萎蔫病抗性树种的培育打下了基础。