铁导致的alpha-突触核蛋白聚集在帕金森病中的作用研究

摘要

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是继阿尔茨海默病之后的第二大神经系统退行性疾病。在我国，65岁以上的人群帕金森病的患病率为1.7％。PD的神经病理学基础是黑质（substantia nigra，SN）致密带多巴胺(dopamine，DA)能神经元的变性脱失以及由此而导致的纹状体DA含量降低。帕金森病的特征性病理结构是路易小体，其主要成分是聚集的alpha-突触核蛋白，另外还有铁，蛋白酶体亚单位，泛素，热休克蛋白等成分。在家族性或散发性帕金森病中，中脑黑质内的alpha-突触核蛋白mRNA水平均有增高。这些结果提示alpha-突触核蛋白与上述路易小体内的成分相互作用可能参与了多巴胺能神经元的选择性死亡。
　　 越来越多的证据表明铁在PD的发病中是一个关键因素，PD病人黑质变性的神经元内均发现铁含量的增高与路易小体的形成。近年来人们发现铁能够促进alpha-突触核蛋白的聚集，但具体机制还不清楚。血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)作为热休克蛋白32，存在于路易小体中。近来的研究发现，细胞内过表达HO-1能够通过激活泛素-蛋白酶体系统而促进alpha-突触核蛋白的降解。在HO-1基因编码区的启动子内存在激活蛋白一1(activtor protein-1，AP-1)序列，被称作抗氧化应激元件(antioxidant responseselements，ARE)，它能够受到具有氧化还原活性的核转录因子(NF-E2-regulated factor2，Nrf2)的精密调节。已证实Nrf2/ HO-1途径是细胞内抗氧化应激的一条重要途径。那么在铁引起的alpha-突触核蛋白聚集过程中是否有Nrf2/HO-1途径的参与呢？
　　 本实验中，我们运用Fe3+或具有氧化还原活性的Fe2+作用于SK-N-SH细胞，运用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法，流式细胞术、PCR、小干涉RNA、硫磺素S染色以及电镜等技术，探讨铁导致alpha-突触核蛋白的聚集及其毒性反应机制。结果发现:
　　 1.细胞内过表达alpha-突触核蛋白对SK-N-SH细胞存活率没有明显的影响，而干涉掉alpha-突触核蛋白48h后细胞存活率下降10％。与对照组相比，在过表达alpha-突触核蛋白的细胞中，Fe3+(100 pmol/L,500μmol/L，1mmol/L，10mmol/L)孵育24h进一步加重了细胞内高铁导致的细胞存活率下降，而同样浓度的Fe3+孵育干涉掉alpha-突触核蛋白的细胞则可阻断存活率的下降。
　　 2.Fe2+(100цmol/L)孵育过表达alpha-突触核蛋白的SK-N-SH细胞4h或Fe3+(100pmol/L,1mmol/L)孵育24h，与对照组相比，细胞内线粒体跨膜电位差（mitochondrial transmembrane potentialΔΨm）的下降及活性氧物质(reactive oxygenspecies，ROS)生成的增多更为明显，而同样浓度的Fe2+或Fe3+孵育干涉掉alpha-突触核蛋白的细胞则可恢复ΔΨm以及抑制ROS的产生。
　　 3.Fe2+(100μmol/L)孵育过表达alpha-突触核蛋白的SK-N-SH细胞4h，能够加重Fe2+引起的细胞凋亡，表现为与对照组相比，Bcl-2mRNA的下调更为明显和电镜观察到凋亡小体的出现，而Fe2+孵育干涉掉alpha-突触核蛋白的细胞未出现细胞凋亡。
　　 4.Fe2+(100μmol/L)孵育过表达alpha-突触核蛋白的SK-N-SH细胞4h或Fe3+(100μmol/L，lmmol/L)孵育24h，细胞内出现明显的聚集。电镜下可见聚集形成的纤维丝以及受损肿胀的线粒体。同样浓度的Fe2+或Fe3+孵育干涉掉alpha-突触核蛋白的细胞未出现聚集。
　　 5.Fe2+(100μmol/L)孵育SK-N-SH细胞24h能够引起Nrf2和HO-1mRNA表达含量的时间依赖性变化。
　　 6.Fe2+(100μmol/L)孵育SK-N-SH细胞4h能够下调Nrf2和HO-1mRNA含量，细胞内过表达alpha-突触核蛋白加重了Nrf2和HO-1mRNA含量的下调，而细胞内干涉掉alpha-突触核蛋白则可使Nrf2和HO-1mRNA含量恢复至正常水平。
　　 7.SK-N-SH细胞内过表达HO-1能够促进alpha-突触核蛋白mRNA的降解。
　　 上述结果表明，铁可以降低细胞ΔΨm、产生过多的ROS及诱导细胞凋亡产生细胞毒性。同时，铁可以通过下调Nrf2和HO-1mRNA表达水平引起细胞内alpha-突触核蛋白的聚集，聚集的alpha-突触核蛋白又可以进一步加重Nrf2和HO-1mRNA水平的下调而实现自身进一步的聚集。聚集的alpha-突触核蛋白又进一步加重了铁的毒性而形成一个恶性循环，最终导致细胞死亡。本实验为脑内铁与alpha-突触核蛋白相互作用损伤多巴胺能神经元提供了新的依据，并为药物干预提供可能的作用靶点。