慢病毒GV115-Survivin转染反分化椎间盘髓核细胞的生物学效应以及GV115-Caspase3 siRNA的构建及其生物学效应

摘要

目的：研究GV115-Survivin转染反分化椎间盘髓核细胞的生物学效应，构建慢病毒GV115-Caspase3 siRNA并研究其生物学效应。
　　方法：采用组织块法分离培养人椎间盘髓核细胞，采用绿色荧光素标记法检测慢病毒载体对其转染效率。通过免疫荧光法、MTT法、Western-Blot法和Antonopulos法检测比较GV115-Survivin对反分化早期和晚期椎间盘髓核细胞Survivin表达、细胞活性、II型胶原和蛋白多糖合成的影响。根据RNA干扰序列设计原则，设计4个可能的Caspase-3 siRNA序列。应用全基因合成技术和亚克隆技术构建GV115-Caspase3 siRNA并采用PCR和测序对其鉴定。病毒包装后转染人胚肾293T细胞，通过应用 RT-PCR技术检测转染后Caspase-3基因敲减效率，筛选高效的GV115-Caspase3 siRNA。采用组织块法分离培养人椎间盘髓核细胞，通过绿色荧光素标记法检测GV115-Caspase3 siRNA对其转染效率。通过免疫荧光法、MTT法、Western-Blot法和Antonopulos法检测GV115-Caspase3 siRNA对反分化晚期髓核细胞Caspase-3表达、细胞活性、II型胶原和蛋白多糖合成的影响。
　　结果：GV115-Survivin可高效转染反分化早期和晚期椎间盘髓核细胞，并促进Survivin表达。对于反分化早期椎间盘髓核细胞，可增强髓核细胞的活性，并促进II型胶原和蛋白多糖的合成；对于反分化晚期的髓核细胞，反而抑制髓核细胞活性以及II型胶原和蛋白多糖的合成。GV115-Caspase3 siRNA质粒PCR鉴定显示位于341bp附近的条带。测序结果与设计的基因序列完全吻合。4个可能的Caspase-3 siRNA序列中基因敲减效率最高的可达到84.2％。GV115-Caspase3 siRNA可高效转染人椎间盘髓核细胞，并抑制反分化晚期Caspase-3表达，增强细胞活性、II型胶原和蛋白多糖的合成。
　　结论：GV115-Survivin可增强反分化早期椎间盘髓核细胞的活性并促进细胞外基质的合成，而对于反分化晚期椎间盘髓核细胞则不适宜采用Survivin基因；成功构建高效的GV115-Caspase3 siRNA重组表达系统，其可增强反分化晚期椎间盘髓核细胞的活性并促进细胞外基质的合成。

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引言

材料

1质粒

2 细菌

3细胞

4 实验仪器

5 实验试剂

6其它化学试剂

第一章 慢病毒GV115-Survivin转染反分化早期和晚期椎间盘髓核细胞生物学效应的比较

1.1方法

1.1.1 技术路线图

1.1.2 人椎间盘髓核细胞的分离培养

1.1.3 反分化早期和晚期椎间盘髓核细胞的建立

1.1.4免疫荧光法检测GV115-Survivin转染前后髓核细胞Survivin的表达

1.1.5 MTT法检测GV115-Survivin转染前后髓核细胞的活性

1.1.6 Antonopulos法检测GV115-Survivin转染前后髓核细胞蛋白多糖的合成

1.1.7 Western-Blot法检测GV115-Survivin转染前后髓核细胞II型胶原的合成

1.1.8 统计学方法

1.2 结果

1.2.1反分化早、晚期人椎间盘髓核细胞

1.2.2 GV115-Survivin的转染效率

1.2.3 椎间盘髓核细胞Survivin蛋白表达的检测比较

1.2.4 椎间盘髓核细胞活性的检测比较

1.2.5 椎间盘髓核细胞II型胶原合成的检测比较

1.2.6 椎间盘髓核细胞蛋白多糖合成的检测比较

第二章 GV115-Caspase3 siRNA重组表达系统的构建及转染反分化晚期椎间盘髓核细胞的生物学效应

2.1方法

2.1.1 技术路线图

2.1.2 Caspase-3 siRNA片段的设计合成

2.1.3 GV115-Caspase3 siRNA重组质粒的制备与鉴定

2.1.4 人胚肾293T细胞的复苏培养及传代

2.1.5 GV115-Caspase3 siRNA病毒的包装

2.1.6 GV115-Caspase3 siRNA病毒感染相关参数的确定

2.1.7 GV115-Caspase3 siRNA病毒的筛选

2.1.8反分化晚期人椎间盘髓核细胞的建立

2.1.9免疫荧光法检测GV115-Caspase3 siRNA转染前后髓核细胞Caspase-3的表达

2.1.10 MTT法检测GV115-Caspase3 siRNA转染前后髓核细胞的活性

2.1.11. Antonopulos法检测GV115-Caspase3 siRNA转染前后髓核细胞蛋白多糖的合成

2.1.12 Western-Blot法检测GV115-Caspase3 siRNA转染前后髓核细胞II型胶原的合成

2.1.13 统计学方法

2.2. 结果

2.2.1 Caspase-3 siRNA片段的设计

2.2.2 Caspase-3 siRNA构建框架及合成片段

2.2.3 GV115-Caspase3 siRNA重组质粒的PCR鉴定

2.2.4 GV115-Caspase3 siRNA重组质粒的测序鉴定

2.2.5 GV115-Caspase3 siRNA病毒感染条件和感染参数的确定

2.2.6 GV115-Caspase3 siRNA病毒筛选实验

2.2.7 人椎间盘髓核细胞及GV115-Caspase3 siRNA对其的转染效率

2.2.8 髓核细胞活性的检测比较

2.2.9 人椎间盘髓核细胞Caspase-3蛋白表达的检测比较

2.2.10 髓核细胞II型胶原合成的检测比较

2.2.11 髓核细胞蛋白多糖合成的检测比较

讨论

结论

参考文献

文献综述：椎间盘髓核细胞凋亡及其基因治疗

攻读学位期间的研究成果

致谢

声明