热休克蛋白70对缺血诱导嗜铬细胞瘤细胞膜钙通道影响的研究

摘要

目的：探讨慢病毒介导的热休克蛋白70(HSP70)对缺血/缺氧嗜铬细胞瘤细胞(PC12)膜钙离子通道的影响及机制。
　　方法：构建表达外源性HSP70的重组慢病毒，感染对数生长期的PC12细胞，用嘌呤霉素筛选稳定表达HSP70的PC12细胞作为实验组，即重组慢病毒感染组[感染含HSP70及绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒]。同时设置慢病毒对照组[感染含GFP基因但不含HSP70基因的慢病毒]和未感染组(正常对照组)。以缺血/缺氧8h、复氧12h刺激PC12细胞模拟体内神经细胞遭受缺血/再灌注时的病理过程，采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测L型钙离子通道cav1.2、cav1.3亚基，受体门控通道基因NR1、NR2，以及Na+/Ca2+交换体(NCX)的mRNA和蛋白表达。
　　结果：①经缺血缺氧再复氧处理后，重组慢病毒感染组细胞cav1.2、NR1、NR2的mRNA及蛋白表达均明显低于慢病毒对照组和未感染组[cav1.2 mRNA(A值)：3.13±0.46比5.12±0.52、5.13±0.66，NR1 mRNA(A值)：1.61±0.44比3.23±0.82、3.31±0.78，NR2 mRNA(A值)：2.09±0.41比3.91±0.64、3.88±0.62，cav1.2蛋白(灰度值)：2.82±0.39比3.98±0.23、3.96±0.24，NR1蛋白(灰度值)：1.84±0.35比2.79±0.21、2.86±0.23，NR2蛋白(灰度值)：0.87±0.24比1.57±0.31、1.33±0.44，均P＜0.01]；而慢病毒对照组与未感染组之间细胞cav1.2、NR1、NR2的mRNA及蛋白表达差异均无统计学意义(均P＞0.01)。②未感染组、慢病毒对照组和重组慢病毒感染组之间细胞 cav1.3、NCX的mRNA和蛋白表达差异均无统计学意义[cav1.3 mRNA(A值)：4.82±0.32、4.72±0.36、4.82±0.29，NCX mRNA(A值)：3.49±0.78、3.47±0.71、3.56±0.65，cav1.3蛋白(灰度值)：2.63±0.40、2.64±0.39、2.68±0.39，NCX蛋白(灰度值)：3.27±0.48、3.34±0.48、3.31±0.42，均P>0.01]。
　　结论：外源性HSP70对PC12细胞膜L型钙离子通道亚基cav1.2及受体门控通道基因的表达有显著影响，可能对缺血/缺氧引起的PC12细胞损伤具有保护作用。

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引言

第一章 材料与方法

1 仪器、试剂和耗材

2 实验方法

3 统计学分析

第二章 结果

1 PC12细胞形态及慢病毒绿色荧光的观察

2 PC12细胞中HSP70的表达

3 PC12细胞中cav1.2、cav1.3、NCX、NR1、NR2的表达

第三章 讨论

1 热休克蛋白70的表达

2 神经元缺血缺氧与热休克蛋白的表达

3 PC12细胞和慢病毒载体的选择

4 HSP70与钙超载

5 研究展望

结论

参考文献

综述: 热休克蛋白70与缺血缺氧神经细胞相关性的研究进展

攻读学位期间的研究成果

致谢

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