肠道菌群失调、益生菌对酒精性肝病的影响及其机制的研究

摘要

目的：通过研究肠道菌群失调、益生菌干预在酒精诱导的鼠肝纤维化发展过程中对TGF-β/Smad信号通路产生的影响及机制，以及对酒精性肝病（alcholic liver disease， ALD）病人肠道菌群的变化特点和给予益生菌制剂所起治疗作用的研究，为进一步探究肝纤维化发生机制和临床ALD的治疗提供理论基础和新途径。 方法：制作小鼠动物模型和招募临床实验对象，分别研究肠道菌群失调和益生菌干预对鼠和人酒精性肝病的影响：（一）1.选择36只C57小鼠按不同的喂饲方式随机等分为三组，I组酒精性肝损伤组：前8周给予含有4%酒精Liber-DeCarli液体饲料饲养，联合微量四氯化碳腹腔注射，建立鼠肝纤维化模型，再继续给予Liber-DeCarli液体饲料的同时，给予酒精相同热量的麦芽糖糊精继续饲养8周。II组酒精性肝损伤合并肠道菌群失调组：前8周在给予与I组小鼠相同的饲养同时，除了酒精，饲料里还含有盐酸林可霉素（6g/kg/d），后8周饲养方法同I组。III组酒精性肝损伤组合并肠道菌群失调加益生菌干预组：前8周饲养与II组相同，后8周除给予与II组相同饲料外，还依据小鼠体表面积添加了0.6g/（kg/d）益生菌VSL#3。16周后每组中半数的小鼠颈椎脱臼处死取肝组织和血样，应用标准试剂盒方法检测血清AST，ALT，ALP；肝组织进行HE染色观察肝组织病理学改变，应用Masson染色评估肝组织纤维化程度，采用ALD组织学评分标准综合评估肝组织病理切片。余下半数小鼠采用链蛋白酶、胶原蛋白酶体内经门静脉灌注法消化肝脏，经过滤离心分离肝星形细胞（HSCs），采用台盼蓝拒染法鉴定细胞活力，采用AnnexinV.FITc/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞仪技术检测鼠肝星形细胞（HSCs）凋亡情况。用Western blot方法检测HSCs有关smad3和smad4蛋白的表达。（二）按照中华医学会肝病学会脂肪肝和酒精肝病学组2010年修订的《酒精性肝病诊疗指南》的诊断标准，招募65名住院ALD病人，随机分组并分别接受14天治疗：标准治疗组（包括戒酒，给予足够的营养支持以及适当的保肝药物，如多烯磷脂酰胆碱等，n=32例）；实验治疗组（给予益生菌制剂口服+标准治疗，n=33）；招募与ALD组病人在年龄、吸烟程度相匹配的30名健康不饮酒成年男性志愿者作为对照组。治疗前后各治疗组取大便样本用微生物学培养方法做定量分析肠道菌群中具有代表性的主要细菌：需氧菌2种（大肠埃希杆菌和粪肠球菌），厌氧菌2种（双歧杆菌和乳酸杆菌），分析比较各组病人肠道菌群构成特点；各治疗组取治疗前后血清做肝酶学和内毒素测定。在研究期间，健康对照组的病人只分别采集一份血和粪便的标本。 结果：（一）与I、III组相比，II组小鼠的血清AST、ALT、ALP水平显著升高（P<0.05）。III组小鼠的血清AST、ALT、ALP水平明显比II组显著降低（P<0.05）。与I组小鼠相比，II组小鼠的ALD组织学评分明显增高；然而III组小鼠在应用益生菌干预后积分较II组明显降低（P<0.05）。与I组小鼠相比，II组小鼠肝组织中HSCs凋亡受到显著抑制（P<0.05）。而III组小鼠在改善了肠道菌群失调后，与I和II组相比，HSCs凋亡均显著增多（P<0.05）。II组小鼠的HSCs中Smad3和Smad4表达与I组相比较都显著上调（P<0.01）。然而在II组和III组比较中，III组鼠HSCs的Smad3和Smad4表达较II组都显著抑制（P<0.01）。 （二）治疗前ALD病人与对照组相比肠道菌群数量显著减少（P<0.05），血清肝酶学显著增高（P<0.05），血清内毒素水平也显著升高（P<0.05）。在14天治疗后，实验治疗组病人肠道菌群数量较标准治疗组有显著升高（P<0.05），且与对照组比较已经没有显著差异。尽管治疗前两组的肝酶学改变与内毒素水平升高与对照组相比差异都具有统计学意义，但是治疗结束后实验组比标准组AST、ALT、内毒素下降更明显（P<0.05）。在酒精性肝炎的亚组中（n=35例），在治疗前两组间肝酶学及内毒素水平相比没有显著差异，治疗后实验组除GGT外，其他指标下降组内比较都有统计学意义(P<0.05)，然而在标准治疗组，组内比较只有AST和TB的下降有统计学意义（P<0.05)。两组间比较，实验治疗组只有AST（P<0.05）和内毒素（P<0.05）与标准治疗组相比有统计学意义。 结论：1.肠道菌群失调可以加重酒精诱导的C57鼠肝损害，加重肝纤维化程度； 2.给予益生菌干预能通过纠正肠道菌群失调减轻酒精诱导的C57鼠肝细胞生化学损害，并可以通过抑制鼠肝纤维化模型的HSCs的smad3和smad4表达，抑制TGFβ/smad信号转导通路的活性，从而抑制HSCs增殖和活化，促进HSCs细胞凋亡，减少细胞外基质的过度产生，进而延缓肝纤维化进程； 3. ALD病人在肝功能受到显著损害的同时，伴存显著的肠道菌群失调，其粪便中有益菌数量显著下降，内毒素血症水平明显增高； 4.益生菌干预治疗可通过纠正ALD患者和酒精诱导的鼠肝纤维化模型的肠道菌群失调，修复和维持肠粘膜屏障功能，降低内毒素血症水平，延缓肝纤维化进程，可能成为治疗肝纤维化的新途径和有效方法。

目录

第一部分 肠道菌群失调通过TGF-β/Smad 信号通路促进酒精诱导的鼠肝纤维化的研究

引言

1 动物模型的建立

2 病理学评估

3 生化分析

4 肝星形细胞分离[14]与检测

5 肝星形细胞凋亡检测

6 免疫印迹（Western blot）法检测

7 统计学分析

1 各组实验小鼠一般情况、肝脏质量及肝指数的比较：

2 血清AST、ALT、ALP：

3 肠道菌群失调促进酒精诱导的鼠肝纤维化

4 肠道菌群失调加重肝组织病理学改变

5 肠道菌群失调抑制鼠HSCs的凋亡。

6 肠道菌群失调和TGFβ/Smad信号通路的关系

讨论

第二部分 益生菌对酒精性肝病治疗作用的研究

引言

1 研究对象

2 实验方法

3 统计学分析

结果

1 ALD病人有显著的肠道菌群失调和肝酶学异常

2 实验治疗组ALD病人的肠道菌群失调显著改善

3 实验治疗组ALD病人肝酶学异常显著改善

讨论

结论

参考文献

综述

攻读学位期间的研究成果

附录或缩略词表

致谢

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