KCNQ钾通道在帕金森病黑质多巴胺能神经元损伤中的作用研究

摘要

帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是常见的神经系统退行性疾病之一，中老年人的发病率较高，被称为威胁中老年人的“第三杀手”疾病。目前，我国已成为全球PD患者人数最多的国家，无论是从家庭的角度还是社会的角度，PD已经成为影响市民生活质量、家庭健康和社会经济迅速发展的重大社会性问题。PD最主要的病理学特征是中脑黑质致密带（substantia nigra pars compacta, SNc）多巴胺（dopamine, DA）能神经元选择性丢失，纹状体（striatum, Str）内代谢产生的DA含量减少，导致PD的一系列相关症状，尤其是运动症状，如静止性震颤、肌僵直、运动不能及姿势反射障碍。很多病理学机制都被证明与PD的发病相关，如：氧化应激、炎症反应、线粒体功能障碍、铁沉积毒性、蛋白异常聚集和细胞凋亡等。诸多的病理学机制使得PD的防治极其复杂，且现行治疗PD的药物副作用不可忽略，因此寻求新的有效治疗的靶点具有重要的意义。
　　近年来有研究表明钾离子通道功能异常与PD的发病密切相关，PD因而也被称为“离子通道病”。Kv7/KCNQ/M通道（亦称KCNQ通道）是电压依赖型钾离子通道，在基底神经节广泛分布，其中免疫组化染色显示KCNQ4亚型在SNc表达丰富。本室的前期研究首次在SNc区DA能神经元中记录到KCNQ电流，并证实利用 KCNQ通道特异性阻断剂10,10二(4-吡啶甲基)-9(10H)-蒽酮（10,10-bis(2-fluoro-4-pyridinylmethyl)-9(10H)-anthracenone, XE991）能够显著抑制KCNQ电流，增强DA能神经元的兴奋性，提高自发放电频率和簇状放电，从而增加Str内DA的释放。然而，以上研究主要关注了正常生理情况下KCNQ通道的功能，并未阐明在PD发病过程中KCNQ通道的生物学效应。因此，本研究旨在探讨KCNQ通道在PD的DA能神经元损伤中的调制作用。
　　本实验通过制备6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）诱导的PD大鼠模型，利用免疫组织化学和免疫印迹技术，观察XE991侧脑室给药后对6-OHDA诱导的黑质（substantia nigra, SN）中酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）阳性神经元数量、TH蛋白表达和Str内TH阳性神经纤维数量的影响；利用高效液相色谱电化学检测（high performance liquid chromatography, HPLC）法观察Str内DA及其代谢产物含量的变化；通过阿朴吗啡（apomorphine, APO）诱导的旋转行为、旷场实验、平衡木实验及握力实验，检测XE991对PD模型大鼠运动速度、平衡能力、运动协调能力和肌强直状况方面的影响；进一步在侧脑室同时给予KCNQ通道开放剂Retigabine，再次观察相关指标的变化。结果如下：
　　1.通过Western blots检测，在正常大鼠SNc区域中，KCNQ通道第4亚基——KCNQ4表达丰富。
　　2.在6-OHDA诱导的PD大鼠模型中，损毁侧SN区TH蛋白表达水平减少为正常对照组的12.5%，与正常对照组相比，差异有极显著性（P＜0.001）。侧脑室分别连续注射XE991（1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L）21天后，5μmol/L和10μmol/L XE991处理组可以拮抗6-OHDA造成的 TH蛋白表达降低，与6-OHDA组相比，差异有显著性（P＜0.05，P＜0.01）。
　　3.在6-OHDA诱导的PD大鼠模型中，损毁侧SN区TH免疫阳性细胞数量下降了83.3%，与正常对照组相比，差异有极显著性（P＜0.001）。侧脑室连续21天注射10μmol/L XE991后，TH免疫阳性细胞数量恢复至正常对照组的45.6%，与6-OHDA组比较，差异有极显著性（P＜0.001）。
　　4.在6-OHDA诱导的PD大鼠模型中，损毁侧Str内DA及其代谢产物二羟基苯乙酸（dihydroxyphenylacetic acid, DOPAC）和高香草酸（homovanillic acid, HVA）的含量均降低，与正常对照组大鼠相比分别降低84.5%、53.2%和53.6%，差异有极显著性（P＜0.001）。侧脑室连续21天注射10μmol/L XE991后，Str内DA、DOPAC和HVA含量与6-OHDA组相比分别升高，差异有显著性（PDA＜0.01，PDOPAC＜0.001，PHVA＜0.01）。
　　5.6-OHDA处理组大鼠与正常对照组相比Str内TH神经末梢数量明显减少。侧脑室连续21天注射10μmol/L XE991后，TH阳性神经末梢数量明显增加。
　　6. XE991对PD大鼠运动障碍有明显的改善作用。在APO诱导的PD大鼠旋转行为中，6-OHDA组大鼠的旋转圈数明显高于正常对照组，差异有极显著性（P＜0.001）；10μmol/L XE991处理组与6-OHDA组大鼠相比，旋转圈数明显减少（P＜0.001）。在旷场实验中，6-OHDA组大鼠在旷场中平均运动速度与正常对照组大鼠相比速度较慢，差异有显著性（P＜0.05）；侧脑室给予XE991（10μmol/L）处理21天之后，平均运动速度与6-OHDA组大鼠相比较快，运动缓慢症状有明显改善，差异有显著性（P＜0.05）。在平衡木实验中，6-OHDA组大鼠在平衡木上的评分与正常对照组大鼠相比较低，平衡能力与运动协调能力明显下降，差异有显著性（P＜0.001）；XE991处理组大鼠平衡木上的评分与6-OHDA组大鼠相比较高，平衡能力与运动协调能力有明显改善，差异有显著性（P＜0.05）。在握力强度实验中，6-OHDA组大鼠在钢丝上悬挂时间与正常对照组大鼠相比有明显的增加，肌强直情况严重，差异有显著性（P＜0.01）；与6-OHDA处理组相比，XE991处理组大鼠肌强直情况明显改善（P＜0.05）。
　　7.在6-OHDA诱导的PD大鼠模型中，损毁侧SN区TH蛋白表达减少，Str内DA、DOPAC和HVA的含量降低，大鼠出现运动缓慢、肌强直症状及平衡能力、运动协调能力下降，XE991处理组大鼠上述指标明显改善；侧脑室同时注射KCNQ钾通道开放剂Retigabine连续21天可以完全拮抗XE991的神经保护作用。
　　以上结果表明，XE991对6-OHDA诱导的PD模型大鼠SN区DA能神经损伤具有保护作用，可以增加SN区TH蛋白水平的表达及TH免疫阳性细胞数目，提高Str区DA及其代谢产物DOPAC和HVA的含量，从而改善SN-Str系统的功能，并有效缓解 PD模型大鼠的运动障碍。进一步实验结果表明 XE991的上述保护作用是通过抑制 KCNQ钾通道来实现的，KCNQ通道特异性开放剂Retigabine可以将XE991的保护作用完全阻断。本实验结果为KCNQ钾通道参与PD提供了新的理论依据，并为PD的药物防治提供新的策略。

目录

引言

材料和方法

1. 动物准备

2. Western bolts法检测SN区TH和KCNQ4蛋白的表达

3. 免疫组织荧光法检测大鼠SN区TH阳性细胞数

4. HPLC检测大鼠损毁侧Str内DA及其代谢产物的含量

5. 免疫组织化学法检测大鼠Str区TH阳性神经纤维染色

6. 行为学检测

7. 统计学分析

结果

1. KCNQ4在大鼠SN区域的表达

2. XE991拮抗6-OHDA诱导的大鼠SN区TH蛋白表达下降

3. XE991拮抗6-OHDA诱导的大鼠SN区TH阳性神经元数量的减少

4. XE991拮抗6-OHDA诱导的PD大鼠模型Str区DA及其代谢产物DOPAC和HVA含量降低

5. XE991拮抗6-OHDA诱导的PD大鼠模型Str区TH免疫阳性神经纤维末梢数量的减少

6. XE991改善6-OHDA诱导的PD大鼠模型运动功能障碍

7. Retigabine可拮抗XE991对6-OHDA 诱导的PD大鼠模型的神经保护作用

讨论

结论

参考文献

综述:钾离子通道与神经系统疾病的相关研究

攻读学位期间的研究成果

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致谢

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