ApoE-/-小鼠颈总动脉粥样硬化不同时间点自噬水平变化的研究

摘要

目的：
　　探究在载脂蛋白E基因敲除小鼠（即ApoE-/-小鼠）颈总动脉粥样硬化的3个时间点自噬水平的变化情况。
　　方法：
　　（1）40只6周龄的SPF级雄性ApoE-/-小鼠，先给与普通饲料喂养2周，随后随机分成对照组（10只）与模型组（30只）。对照组进行假手术（ApoE-/-小鼠右侧颈总动脉旁放置硅胶管）处理，而后继续普通饲料喂养8周；模型组给与手术（右侧颈总动脉外套置硅胶管）处理，手术后随机分成3组（2周组、4周组、8周组），每组各10只，并且均换成高脂饲料，分别喂养2周、4周、8周后处死。
　　（2）分离并剪断ApoE-/-小鼠的股动脉进行取血，检测每只ApoE-/-小鼠血清中甘油三脂（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL_c）的含量。
　　（3）ApoE-/-小鼠取血后处死，分离取出套管侧颈总动脉，固定后做石蜡切片，HE染色，应用光学显微镜观察每组血管壁结构的变化。
　　（4）离体的套管侧颈总动脉经固定后，做超薄切片并染色，应用透射电镜观察每组小鼠颈总动脉组织巨噬细胞的超微结构。
　　（5）提取各组ApoE-/-小鼠套管侧颈总动脉组织的总RNA，经反转录后，应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测每组小鼠颈总动脉组织中ATG5、Beclin1的mRNA的相对表达量。
　　（6）提取各组 ApoE-/-小鼠套管侧颈总动脉组织中的总蛋白，应用 western blot检测每组小鼠颈总动脉组织中ATG5、Beclin1蛋白的相对表达量。
　　结果：
　　（1）与对照组相比较，模型组ApoE-/-小鼠的血脂水平均升高（P＜0.05）；模型组中TG和LDL_c的表达水平随着套管手术时间延长而逐渐升高（P＜0.05）。
　　（2）组织病理学观察显示，对照组ApoE-/-小鼠颈总动脉管壁结构比较完整，且弹性膜较为丰富。2周组小鼠管壁结构仍较完整，但是一小部分管壁增厚并见有少量细胞浸润。4周组小鼠管壁结构较为凌乱，而且见有泡沫细胞、炎性细胞的浸润。8周组小鼠管壁明显增厚而且有大量泡沫细胞、炎性细胞浸润，弹性膜结构破坏且明显减少，管腔狭窄。
　　（3）透射电镜观察显示，与对照组相比较，模型组ApoE-/-小鼠颈总动脉组织巨噬细胞中的脂滴和自噬体数目均明显增多，4周组巨噬细胞内脂滴和自噬体数目明显多于2 周组，8周组巨噬细胞内的脂滴数目明显多于4周组，但其自噬体数目远远少于4周组。（4）实时荧光定量PCR结果显示，2周组ApoE-/-小鼠颈总动脉组织中ATG5、Beclin1的mRNA的相对表达量与对照组无明显差异（P＞0.05），4周组和8周组ATG5、Beclin1的mRNA的表达均高于对照组（P＜0.05）；4周组ATG5、Beclin1的mRNA的表达均高于2周组和8周组，而且，8周组ATG5、Beclin1的mRNA的表达高于2周组（P＜0.05）。（5）western blot结果显示，2周组ApoE-/-小鼠颈总动脉组织中ATG5、Beclin1蛋白的相对表达量与对照组相比较无明显差异（P＞0.05），4周组和8周组ATG5、Beclin1蛋白的表达均高于对照组（P＜0.05）；4周组ATG5、Beclin1蛋白的表达均高于2周组和8周组，而且，8周组ATG5、Beclin1蛋白的表达高于2周组（P＜0.05）。
　　结论：
　　在 ApoE-/-小鼠颈总动脉粥样硬化的疾病过程中，自噬在起始阶段不断激活，自噬水平逐渐升高，但是，自噬水平在动脉粥样硬化的某一时间点（本实验中为套管手术4周后）将会达到峰值，而后逐渐降低。

目录

引言

材料与方法

1 实验动物

2 主要仪器

3 试剂与药品

4 实验动物处理

5 小鼠血脂的检测

6 ApoE-/-小鼠套管侧颈总动脉组织显微结构观察

7 颈总动脉组织超微结构观察

8 实时荧光定量PCR检测自噬相关mRNA表达

9 Western blot 检测自噬相关蛋白的表达

10 统计学分析

结果

1 ApoE-/-小鼠血脂水平变化

2 ApoE-/-小鼠颈总动脉组织显微结构

3 ApoE-/-小鼠颈总动脉组织超微结构

4 自噬相关因子mRNA表达结果

5 自噬相关蛋白表达结果

讨论

结论

参考文献

综述:自噬信号通路及其与动脉粥样硬化的关系

攻读学位期间的研究成果

致谢

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