铁和细胞外α-突触核蛋白影响体外培养的星形胶质细胞的作用研究

摘要

帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是一种以黑质致密带多巴胺（dopamine, DA）能神经元进行性缺失为特征的中枢神经系统退行性疾病。其临床表现为运动不能、肌僵直、静止性震颤及姿势反射障碍等。尽管研究显示遗传、环境和年龄等因素均可能参与PD发病，但其确切病因不清。PD的主要病理特征是黑质（substantia nigra, SN）致密部多巴胺能神经元缺失和路易小体（Lewy body, LB）的形成。α-突触核蛋白是LB的主要成分，神经元中α-突触核蛋白的异常聚集能够改变细胞膜电位、损伤线粒体功能、诱导内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激而造成细胞损伤，其中内质网应激是α-突触核蛋白的核心毒性作用机制之一。除了长期以来关注的其在细胞内的毒性作用之外，α-突触核蛋白能够被神经元释放，进而被周围的细胞（包括神经元、胶质细胞等）再摄取，从而能够在细胞-细胞之间、相互联系的结构之间进行传递。铁沉积是PD另一重要的神经病理学改变，尸检证据表明，PD黑质区单个神经元内的铁含量增高，黑质铁的水平与PD的进程相关。本课题组前期研究证实铁能够促进α-突触核蛋白的聚集，增强α-突触核蛋白在细胞内的毒性作用，然而铁沉积与细胞间传播的α-突触核蛋白之间的关系尚未有研究报道。
　　以往神经退行性疾病的研究热点都集中在特定受损的神经元上，占脑体积20%-50%的星形胶质细胞在神经系统的发育、突触传递、离子平衡、神经免疫等方面，都起着十分重要的作用，因此星形胶质细胞在神经退行性疾病的作用开始受到关注。星形胶质细胞本身表达极低水平的α-突触核蛋白，但其能摄取胞外的α-突触核蛋白。进入到星形胶质细胞内的α-突触核蛋白的聚集促进促炎因子和化学因子的释放，进而导致神经元的损伤和小胶质细胞的继发性激活。本研究选用C6胶质瘤细胞（星形胶质细胞瘤的细胞系），原代培养的腹侧中脑（ventral mesencephalon，VM）星形胶质细胞及VM神经元为细胞模型，应用蛋白免疫印迹、免疫荧光、荧光实时定量PCR、流式细胞术等方法，深入探讨细胞外的α-突触核蛋白处理后VM星形胶质细胞促炎因子的变化及铁对此过程的影响，并评价内质网应激是否参与了细胞外α-突触核蛋白的毒性作用，并观察VM神经元的损伤变化。研究结果如下：
　　1.100 nmol/L、300 nmol/L的α-突触核蛋白单体处理C6胶质瘤细胞24 h后，IL-1βmRNA的升高分别约为对照组的1.83、2.69倍，TNF-αmRNA的升高分别约为对照组的1.35、1.74倍，与对照组相比差别有统计学意义（P＜0.01）；且100 nmol/L组与300 nmol/L组相比差别有统计学意义（P＜0.01）。以上结果说明，α-突触核蛋白单体能够引起C6胶质瘤细胞促炎因子表达增加，且促炎因子的表达升高对α-突触核蛋白具有浓度依赖性。
　　2.100 nmol/L、300 nmol/L的α-突触核蛋白单体处理VM星形胶质细胞24 h后, IL-1βmRNA的升高分别约为对照组的9.58、21.7倍，TNF-αmRNA的升高分别约为对照组的4.80、6.17倍，与对照组相比差别有统计学意义（P＜0.0001），且100 nmol/L组与300 nmol/L组相比差别有统计学意义（P＜0.01）。以上结果说明，α-突触核蛋白单体能够引起VM星形胶质细胞促炎因子表达增加，且促炎因子的升高对α-突触核蛋白具有浓度依赖性。
　　3.100μmol/Lα-突触核蛋白单体37℃恒温振荡3 d，制备α-突触核蛋白纤维体。100 nmol/L、300 nmol/L的α-突触核蛋白纤维体处理VM星形胶质细胞24 h后，IL-1βmRNA的升高分别约为对照组的3.22、7.91倍，TNF-αmRNA的升高分别约为对照组的3.09、4.33倍，与对照组相比差别有统计学意义（P＜0.05），且100 nmol/L组与300 nmol/L组相比差别有统计学意义（P＜0.05）。α-突触核蛋白纤维体引起促炎因子的升高水平低于α-突触核蛋白单体组，与α-突触核蛋白单体组相比，差别有统计学意义（P＜0.05）。以上结果说明，α-突触核蛋白纤维体也能够引起VM星形胶质细胞促炎因子表达增加，且促炎因子的升高对α-突触核蛋白具有浓度依赖性；但α-突触核蛋白单体对VM星形胶质细胞的毒性要高于α-突触核蛋白纤维体。
　　4.100 nmol/L的α-突触核蛋白单体处理C6胶质瘤细胞24 h后，内质网应激相关蛋白CHOP、ATF-4、XBP-1s的表达升高，分别约为对照组的1.33、2.05、1.24倍，与对照组相比差别有统计学意义（P＜0.05）。300 nmol/L的α-突触核蛋白组，CHOP、ATF-4、XBP-1s的表达升高，分别约为对照组的1.50、2.10、1.25倍，与对照组相比差别有统计学意义（P＜0.05）。以上结果说明，细胞外的α-突触核蛋白能够诱导C6胶质瘤细胞出现内质网应激。自噬溶酶体途径（autophagy-lysosome pathway, ALP）抑制剂氯喹（40μmol/L）或泛素蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system, UPS）抑制剂MG132（20μmol/L）单独处理细胞24 h后，CHOP、ATF-4的表达升高，提示抑制ALP或UPS均可诱导细胞出现内质网应激。氯喹与α-突触核蛋白共孵育后与单独氯喹处理组相比没有显著差别，提示进入细胞内的α-突触核蛋白能够经UPS降解。而MG132与α-突触核蛋白共孵育后与单独MG132处理组相比明显下降，差别有统计学意义（P＜0.0001）。以上结果说明，进入到细胞内的α-突触核蛋白可以诱导C6胶质瘤细胞出现内质网应激；细胞外进入到细胞内的α-突触核蛋白可以经UPS和ALP降解，且ALP在UPS被抑制的情况下更容易被细胞外的α-突触核蛋白诱导增强。
　　5.100 nmol/L的α-突触核蛋白单体处理VM星形胶质细胞24 h后，内质网应激相关蛋白CHOP、ATF-4、XBP-1s的表达升高，分别约为对照组的1.96、2.23、1.29倍，与对照组相比差别有统计学意义（P＜0.05）。300 nmol/L的α-突触核蛋白组，CHOP、ATF-4、XBP-1s的表达升高，分别约为对照组的2.02、2.32、1.48倍，与对照组相比差别有统计学意义（P＜0.05）。以上结果说明，α-突触核蛋白能够诱导VM星形胶质细胞出现内质网应激。
　　6.10μmol/L、100μmol/L枸橼酸铁铵（ferric ammonium citrate, FAC）处理C6胶质瘤细胞24 h后，10μmol/L FAC组促炎因子表达量较对照组没有变化，与100 nmol/L的α-突触核蛋白单体共孵育细胞24 h后，促炎因子的表达量较α-突触核蛋白组没有显著变化。100μmol/L FAC组促炎因子表达量较对照组增加，IL-1β、TNF-αmRNA的升高约为对照组的1.72、1.37倍，差别有统计学意义（P＜0.05），与100 nmol/L的α-突触核蛋白单体共孵育细胞24 h后，促炎因子的表达量较α-突触核蛋白组也没有显著变化。以上结果说明，C6胶质瘤细胞内铁水平升高对细胞外α-突触核蛋白的毒性作用没有明显影响。
　　7.10μmol/L FAC处理VM星形胶质细胞24 h后，促炎因子IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平有升高的趋势，但无统计学意义（P＞0.05），与100 nmol/L的α-突触核蛋白单体共孵育VM星形胶质细胞24 h后，可诱导α-突触核蛋白引起的促炎因子释放量增加，与对照组相比，IL-1β、TNF-αmRNA分别约升高11.92、4.95倍，差别有统计学意义（P＜0.0001）；与α-突触核蛋白组相比，IL-1β、TNF-αmRNA分别约升高26%、18%，差别有统计学意义（P＜0.05）。100μmol/L FAC处理VM星形胶质细胞24 h后，促炎因子IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平也有升高的趋势，且与对照组相比，TNF-αmRNA的升高有统计学意义（P＜0.05），与100 nmol/L的α-突触核蛋白单体共孵育细胞24 h后，可诱导α-突触核蛋白引起的促炎因子表达量增加，与对照组相比，IL-1β、TNF-αmRNA分别约升高11.59、6.05倍，差别有统计学意义（P＜0.0001）；与α-突触核蛋白组相比，IL-1β、TNF-αmRNA分别约升高22%、44%，差别有统计学意义（P＜0.01）。以上结果说明，原代培养的VM星形胶质细胞内铁水平升高增强细胞外α-突触核蛋白的毒性作用。
　　8.100μmol/L FAC处理VM星形胶质细胞24 h后，CHOP、ATF-4、XBP-1s的表达有升高的趋势，且与对照组相比，ATF-4的升高有统计学意义（P＜0.01），100 nmol/L的α-突触核蛋白与100μmol/L FAC共孵育VM星形胶质细胞24 h后，CHOP、ATF-4、XBP-1s的表达升高，与对照组相比，分别约升高1.61、1.93、2.26倍，差别有统计学意义（P＜0.001）；与α-突触核蛋白组相比，CHOP、ATF-4、XBP-1s分别约升高1.24、1.25、1.76倍，差别有统计学意义（P＜0.05）。以上结果说明，原代培养的VM星形胶质细胞内铁水平升高增强细胞外α-突触核蛋白诱导的内质网应激。
　　9.100 nmol/L、300 nmol/L的α-突触核蛋白单体处理VM神经元24 h后，与对照组相比ΔΨm分别下降12%、15%，差别有统计学意义（P＜0.001）。100 nmol/L的α-突触核蛋白单体处理VM神经元24 h后，内质网应激相关蛋白CHOP、ATF-4、XBP-1s的表达升高，分别约为对照组的1.62、1.26、1.21倍，与对照组相比差别有统计学意义（P＜0.05）。300 nmol/L的α-突触核蛋白组，CHOP、ATF-4、XBP-1s的表达升高，分别约为对照组的1.33、1.25、1.28倍，与对照组相比差别有统计学意义（P＜0.05）。以上结果说明，α-突触核蛋白能够诱导VM神经元出现内质网应激。
　　以上结果表明，细胞外的α-突触核蛋白单体能够引起C6胶质瘤细胞和VM星形胶质细胞促炎因子IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平的升高，并且α-突触核蛋白纤维体也引起促炎因子的升高，但是升高水平低于α-突触核蛋白单体组，表明细胞外进入细胞内的α-突触核蛋白能够引起VM星形胶质细胞促炎因子表达水平增加，且α-突触核蛋白单体的毒性要高于α-突触核蛋白纤维体。进入到细胞内的α-突触核蛋白可以经UPS和ALP途径降解，且ALP在UPS被抑制的情况下激活更明显。细胞外的进入到细胞内的α-突触核蛋白可诱导C6胶质瘤细胞和VM星形胶质细胞内质网应激相关蛋白CHOP、ATF-4、XBP-1s的表达升高。细胞内高铁会进一步增强细胞外的α-突触核蛋白诱导VM星形胶质细胞促炎因子表达增加和内质网应激水平。本实验在星形胶质细胞中，探讨了铁沉积与细胞间传播的α-突触核蛋白之间的关系，为进一步阐明PD发病过程中铁与α-突触核蛋白相互作用的机制及干预措施，提供了新的实验依据。

目录

引言

材料与方法

1. C6胶质瘤细胞的培养，VM星形胶质细胞和VM神经元的原代培养

2. 免疫荧光方法鉴定原代培养星形胶质细胞、VM神经元纯度

3. 荧光实时定量PCR 检测C6胶质瘤细胞、VM星形胶质细胞IL-1β、TNF-αmRNA表达

4. 细胞内线粒体膜电位（ΔΨm）的检测

5. CHOP、ATF-4、XBP-1s蛋白表达的检测

6. 数据处理及统计学分析

结果

1. 免疫荧光技术鉴定原代培养的VM星形胶质细胞和神经元的纯度

2.α-突触核蛋白增加C6胶质瘤细胞IL-1β、TNF-α的mRNA水平

3.α-突触核蛋白增加VM星形胶质细胞IL-1β、TNF-α的mRNA水平

4.α-突触核蛋白上调C6胶质瘤细胞内质网应激相关蛋白的表达

5.α-突触核蛋白上调VM星形胶质细胞内质网应激相关蛋白的表达

6. 铁对α-突触核蛋白处理的C6胶质瘤细胞IL-1β、TNF-α的 mRNA水平的影响

7. 铁对α-突触核蛋白处理的 VM 星形胶质细胞IL-1β、TNF-α的mRNA水平的影响

8. 铁对α-突触核蛋白处理的VM星形胶质细胞内质网应激相关蛋白水平的影响

9.α-突触核蛋白诱导VM神经元ΔΨm下降

10.α-突触核蛋白上调VM神经元内质网应激相关蛋白的表达

讨论

结论

参考文献

综述:内质网应激与疾病的发生

攻读学位期间的研究成果

缩 略 词 表

致谢

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