α-突触核蛋白在BV2小胶质细胞铁代谢中的作用及其分子机制

摘要

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是中枢神经系统的退行性疾病。主要症状是肌肉僵直，静止性震颤和姿势反射障碍，它是继阿尔茨海默病之后的第二大神经系统退行性疾病。PD的主要病理学特征是黑质致密带（substantia nigra pars compactor，SNpc）多巴胺(dopamine，DA)能神经元的损伤，残存的神经元内出现以α-突触核蛋白（α-synuclein，α-syn）为主要成分的酸性包涵体（lewy body，LBs）。虽然遗传，环境和氧化应激发挥一定的作用，但PD的确切发病机制尚未完全了解。
　　在PD的发病过程当中，铁起到了关键的作用，铁的过度沉积可能参与了PD DA能神经元的变性死亡过程。研究显示铁转入蛋白二价金属离子转运蛋白（divalent metal-ion transporter-1，DMT1）在PD病人和PD模型的黑质（substantia nigra，SN）内高表达，表明DMT1的代谢紊乱可能导致了该区铁的选择性聚积，最终导致神经元的死亡。Ferroportin1（FPN1）是目前所知唯一一种跨膜的铁转出蛋白，FPN1的功能缺失会引起铁代谢的紊乱。铁调节蛋白(iron regulatory proteins，IRPs)是铁代谢相关蛋白的转录后调节的最重要的因素，可与DMT1 mRNA的3’端铁应答元件（iron response element，IRE）和FPN1 mRNA5’端的IRE结合，调控铁代谢相关蛋白表达。最近许多研究表明缺氧诱导因子（hypoxia‐inducible factors，HIFs）是铁稳态的重要决定因素。除了缺氧，许多其他刺激可以激活HIFs，HIFs与缺氧反应元件（hypoxic response elements，HRE）结合形成转录起始复合物，调控铁代谢相关蛋白表达。
　　α-Syn是一个140氨基酸残基的细胞溶质性神经元蛋白，主要合成于突触终端，据报道α-Syn主要与突触小泡运输，突触囊泡池的调控有关。α-syn作为LBs的主要成分，在SN中聚集形成不溶性聚集体并引起神经毒性。神经病理学研究发现SN内α-syn的异常聚集常常伴有铁沉积，近来研究发现，α-syn是铁还原酶，能将Fe3+还原成Fe2+。α-syn本身作为一种铁代谢相关的蛋白，其表达异常必然参与了细胞铁代谢。但是，铁和α-syn相互联系的具体分子机制仍然不清楚。
　　PD SN神经元和小胶质细胞有铁的沉积。小胶质细胞不能合成α-syn但可以吞噬α-syn，那么吞噬的α-syn对小胶质细胞铁代谢有什么影响?本研究应用外源性α-syn处理小胶质细胞，观察了α-syn单体（monomericα-synuclein，M-α-syn）和α-syn寡聚体(oligomericα-synuclein，O-α-syn)的铁还原酶活性以及α-syn对小胶质细胞铁代谢的影响。
　　结果如下：
　　1.0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6μmol/L、7μmol/L、8μmol/L M-α-syn处理 BV2小胶质细胞24 h，结果显示0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L组活性与对照组相比细胞的存活率没有明显变化（P＞0.05, n=6）。因此选定1μmol/L，3μmol/L，5μmol/L为后面实验中所应用浓度。
　　2.0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6μmol/L、7μmol/L、8μmol/L O-α-syn处理 BV2小胶质细胞24 h，结果显示0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L组活性与对照组相比细胞的存活率没有明显变化（P＞0.05, n=6）。因此选定1μmol/L，3μmol/L，5μmol/L为后面实验中所应用浓度。
　　3.1μmol/L，3μmol/L，5μmol/L的M-α-syn处理BV2小胶质细胞系24小时，DMT1表达量明显上调，5μmol/L表达量是对照组的1倍（P＜0.001, compared with control group. n=6），而FPN1表达量并未发生明显改变（P＞0.05, n=6）。
　　4.1μmol/L，3μmol/L，5μmol/L的M-α-syn处理BV2小胶质细胞系24小时，IRP1和HIF-2α表达量并未发生明显改变（P＞0.05, n=6）。
　　5.1μmol/L，3μmol/L，5μmol/L的O-α-syn处理BV2小胶质细胞系24小时，DMT1和FPN1表达量明显上调，DMT1和FPN1表达量在3μmol/L时最高，是对照组的1倍（P＜0.001,n=6）。
　　6.1μmol/L，3μmol/L，5μmol/L的O-α-syn处理BV2小胶质细胞系24小时，IRP1和HIF-2α表达量并未发生明显改变（P＞0.05, n=6）。
　　7.1μmol/L M-α-syn及O-α-syn处理BV2小胶质细胞24h，可以增加细胞对Fe2+的摄取，与对照组相比差别有统计学意义(P＜0.01，n=6)。
　　8.1μmol/L M-α-syn处理BV2小胶质细胞24h，细胞对Fe2+的转出，与对照组相比并无明显变化，差别没有统计学意义（P＞0.05, n=6）,1μmol/L O-α-syn处理BV2小胶质细胞24h，细胞对Fe2+的转出明显增强，与对照组相比差别有统计学意义（(P＜0.01，n=6）
　　9.100μmol/L M-α-syn及O-α-syn处理BV2小胶质细胞4h，加入Ferrozine溶液（100μmol/L）、NADH溶液（100μmol/L）、MOPS溶液（100mmol/L）、Cuso4溶液（300μmol/L）、FAC溶液（100μmol/L），酶标仪562nm处检测M-α-syn以及O-α-syn铁还原酶活性升高，与对照组相比差别有统计学意义(P＜0.01，n=6)，O-α-syn铁还原酶活性高于M-α-syn活性，差别有统计学意义(P＜0.05，n=6)。
　　上述结果表明：M-α-syn及O-α-syn均有铁还原酶活性，且O-α-syn活性强于M-α-syn。α-syn参与了BV2小胶质细胞铁的代谢，M-α-syn和O-α-syn引起DMT1表达的增加，铁转入增多。O-α-syn引起FPN1表达的增加，铁转出增强。α-syn对BV2小胶质细胞铁的代谢的影响与IRP1和HIF-2α的调节无关，而与α-syn铁还原酶活性有关。本研究为α-syn参与小胶质细胞铁代谢提供了强有力的实验依据。

目录

引言

材料和方法

1 细胞培养

2α-syn寡聚体的制备

3 MTT方法检测细胞存活率

4 DMT1/FPN1蛋白表达检测

5 IRP1/HIF-2α蛋白表达检测

6 BV2细胞铁转运功能检测

7α-syn高铁还原酶活性检测

8 数据处理和统计学检验

结果

1α-syn寡聚体的制备

2α-syn单体/寡聚体对BV2小胶质细胞活力的影响

3α-syn单体/寡聚体预处理BV2细胞24h后DMT1蛋白表达变化

4α-syn单体/寡聚体预处理BV2细胞24h后FPN1蛋白表达变化

5α-syn单体/寡聚体预处理BV2细胞24h后IRP1蛋白表达变化

6α-syn单体/寡聚体预处理BV2细胞24h后HIF-2α蛋白表达变化

7α-syn单体/寡聚体对BV2细胞铁转运功能的影响

8α-syn高铁还原酶活性的检测

讨论

结论

参考文献

综述:Alpha-突触核蛋白：小胶质细胞的激活及其铁代谢

缩 略 词 表

攻读学位期间的研究成果

致谢

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