TLR4基因突变小鼠C3H/HeJ在坐骨神经损伤修复中的作用研究

摘要

目的:在固有免疫识别系统中，Toll-like receptors是一类非常重要的模式识别受体。由TLRs引发的免疫反应在生理或病理状态下都能起到重要的调节作用。周围神经损伤后，神经修复缓慢且分子机制不详，故本实验利用TLR4突变型小鼠C3H/HeJ构建坐骨神经损伤模型，探究炎症因子的表达变化与坐骨神经修复质量和速度的关系，旨在进一步揭示TLR4介导的信号通路与坐骨神经损伤修复的关系，为神经损伤修复提供实验依据。 方法:C3H/HeJ小鼠为TLR4基因突变型小鼠；C3H/HeN小鼠为野生型小鼠。实验设C3H/HeJ夹伤组(HeJ)、C3H/HeN夹伤组(HeN)及C3H/HeN假手术组(control)。在无菌操作下，构建小鼠坐骨神经夹伤模型。实验指标检测分为急性损伤期和慢性期两个阶段进行，急性期指标分别于损伤后6h、12h、24h和48h，RT-qPCR检测损伤神经IL-1β,IL-6,TNF-α,MCP-1,Nlrp3,Nlrp6和caspase1因子基因水平的表达变化。损伤后12h和24h，Western Blot检测损伤神经p75NTR,GAP-43,NF-κB,Nlrp3,Nlrp6和caspase1蛋白水平的表达变化。慢性期指标分别于术后1周、2周、4周和8周取小鼠坐骨神经，HE染色观察炎症细胞表达及神经修复情况，在同期利用免疫组化检测GAP-43,p75NTR,Nlrp3,Nlrp6和caspase1蛋白表达情况。坐骨神经功能指数(Sciatic functional index,SFI)用来评价小鼠后肢坐骨神经运动功能恢复状况。 结果:急性期检测结果：RT-qPCR表明坐骨神经损伤后6h,12h和24h时，与control组相比，HeN组小鼠IL-1β,IL-6,TNF-α和MCP-1的表达量显著升高(P＜0.01)，而HeJ组小鼠升高变化不明显。相比HeN组与HeJ组小鼠，TNF-α的检测结果在同期差异显著(P＜0.01)。Western blot结果显示，与HeN组小鼠相比，坐骨神经损伤后的12h或24h时,HeJ组小鼠p75NTR蛋白表达水平显著升高(P＜0.001)。在Nlrp3蛋白表达没有差异，而Nlrp6蛋白表达在HeJ组小鼠中显著升高的情况下，caspase1蛋白表达水平在两实验组中均升高，caspase1具有不依赖Nlrp3的信号通路。慢性期测定结果：HE染色结果表明神经损伤后1周、2周、4周和8周，与HeN组小鼠相比，HeJ组小鼠神经损伤处淋巴细胞表达较少，炎性反应较弱，且在同期通过免疫组化检测，HeJ组小鼠中GAP-43和p75NTR的蛋白表达水平显著升高(P＜0.01)。Nlrp6的蛋白表达在HeJ组小鼠中表达较高，而Nlrp3和caspase1的表达在两实验组间没有差异。HeN组小鼠和HeJ组小鼠的SFI评分结果显示，与HeN组小鼠相比，在坐骨神经损伤后同期，HeJ组小鼠的SFI评分更高。 结论:成功构建了突变小鼠坐骨神经损伤模型，阐明在TLR4突变小鼠中可以通过减少多种炎性因子的释放，而加快小鼠坐骨神经的损伤修复。炎症小体的表达具有不依赖Nlrp3的通路，Nlrp6的表达升高可能抑制炎症反应而有利于神经修复，这为进一步探究炎症与周围神经损伤修复提供了实验理论依据。

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