二氢青蒿素促进T细胞淋巴瘤c-Myc蛋白降解及抑制AKT信号通路的研究

摘要

目的：研究二氢青蒿素（DHA）对T细胞淋巴瘤细胞（Jurkat和HuT78细胞）c-Myc蛋白磷酸化降解的影响，探讨DHA对T细胞淋巴瘤的作用机制。 方法：取对数生长期的T细胞淋巴瘤细胞（Jurkat和HuT78细胞）进行实验。DHA作用于Jurkat和HuT78细胞后，利用CCK-8法检测细胞增殖，计算细胞增殖率；利用流式细胞仪检测Jurkat和HuT78细胞凋亡；利用实时荧光定量PCR法检测c-Myc、AKT、GSK3βmRNA的表达，以GAPDH作为内参，计算c-Myc、AKT、GSK3βmRNA的相对表达量；利用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测c-Myc、p-c-Myc、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β蛋白的表达，以GAPDH作为内参，应用Image J软件进行灰度值分析c-Myc、p-c-Myc、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β蛋白的相对表达量。通过检测上述指标，分析DHA对T细胞淋巴瘤细胞c-Myc蛋白磷酸化降解及对AKT/GSK3β信号通路的影响。 结果：DHA可以明显降低Jurkat和HuT78细胞的细胞密度，影响细胞膜的完整性；DHA能够抑制Jurkat和HuT78细胞的增殖活性，该抑制作用具有时间和浓度依赖性，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。根据CCK-8实验结果，分析得出DHA对Jurkat细胞作用的IC50为16.63μM，HuT78的IC50为33.35μM；DHA可以促进Jurkat和HuT78细胞的凋亡，15μM DHA作用于Jurkat细胞48h后，凋亡率上升到32.44%，对照组凋亡率为1.53%，与对照组相比差异有统计学意义（＜0.05）；30μM DHA作用于HuT78细胞48h后，凋亡率增加到22.81%，对照组的凋亡率为1.65%，与对照组相比差异亦有统计学意义（P＜0.05）。RT-PCR实验结果显示：DHA可以下调Bcl-2mRNA的表达，与对照组相比Jurkat、HuT78细胞的Bcl-2mRNA表达分别下降57%、64%，差异均有统计学意义（P＜0.05）；DHA可以上调Bax mRNA的表达，与对照组相比差异亦有统计学意义（P＜0.05）；DHA可以下调c-Myc mRNA的表达，与对照组相比Jurkat细胞的c-Myc mRNA表达下降了43%，HuT78细胞的c-Myc mRNA表达下降了46%，差异均有统计学意义（P＜0.05）；而DHA对AKT、GSK3βmRNA的表达水平影响不大（P＞0.05）。蛋白免疫印迹结果显示：DHA使Jurkat细胞Bcl-2、c-Myc、p-AKT、p-GSK3β蛋白的表达量分别下调42%，31%，20%，16%，差异有统计学意义（P＜0.05）；使HuT78细胞Bcl-2、c-Myc、p-AKT、p-GSK3β蛋白的表达量分别下调63%，30%，23%，15%，差异有统计学意义（P＜0.05）；DHA增加Jurkat、HuT78细胞的Bax蛋白表达量分别达41%、51%，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；DHA使Jurkat细胞p-c-Myc蛋白的表达量增加了34%，使HuT78细胞p-c-Myc蛋白的表达量增加了25%，与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.01）。 结论：DHA抑制Jurkat和HuT78T细胞淋巴瘤细胞的增殖，促进其凋亡，作用机制可能通过以下途径实现：DHA下调c-Myc mRNA的表达，进而降低c-Myc蛋白的表达量；DHA能够加强c-Myc蛋白的磷酸化，促进其降解；DHA可以抑制AKT/GSK3β信号通路，下调p-AKT、p-GSK3β蛋白的表达量。本实验为DHA治疗T细胞淋巴瘤提供了一定的实验依据，并探讨了其具体的作用机制。

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学术硕士学位论文

Abstract

将Jurkat细胞(1×106/孔)和HuT 78细胞(1.5×106/孔)分别接种于6孔板中，分为

流式细胞仪进行细胞凋亡检测。

根据1.5中的实验分组加入二氢青蒿素作用于Jurkat、HuT 78细胞48h后，分别收集细胞。因R

6.1 RNAiso plus法提取细胞总RNA

分别收集Jurkat、HuT 78细胞，1000 r/min离心5min，弃上清；加入5mL PBS

6.3 引物设计及合成

通过GenBank查找c-Myc、AKT、GSK3β的序列，引物由青岛擎科公司设计合成。以GAPDH

表1.3 RTPCR基因引物序列

7.1 提取细胞蛋白及测定蛋白浓度

收集Jurkat、HuT 78细胞，1000r/min,离心5min，弃上清；加入1mL PBS吹打

7.2 蛋白变性

蛋白样品测完浓度后，以蛋白/上样缓冲液= 5/1比例，向蛋白样品中加入上样缓冲液，充分摇均，金属浴1

7.3 Western blot具体操作步骤

7.3.1 配胶、加样与电泳

根据SDS-PAGE配胶试剂盒的说明和目的蛋白分子量的大小选择合适的分离胶浓度，浓缩胶均为5%。先配

蛋白样品的一侧加入5μL Marker标记蛋白分子量大小。设置电压Us=80V 30min，Us=1

7.3.2 转膜

在平底容器中加入转膜缓冲液，在黑色和白色转膜板上分别放3层滤纸（注意中间无气泡），然后把含有蛋白的胶

7.3.3 封闭

转膜结束后，蛋白转到PVDF膜上，将膜取出放到合适的容器中，加入5mL TBST冲洗PVDF膜5mi

膜。加入脱脂奶粉和TBS配置成5%的封闭液，常温下置于摇床上封闭2h。

7.3.4 与一抗反应

将封闭好的PVDF膜，用TBST冲洗，15min/次，共3次。加入配好的一抗5mL，必须使一抗完全没

7.3.5 与二抗反应

回收一抗，用TBST冲洗PVDF膜，15min/次，共3次。加入配好的二抗，必须使二抗完全没过PV

7.3.6 显影

回收二抗，用TBST冲洗PVDF膜，15min/次，共3次。将ECL化学发光试剂盒中的A液和B液按1

7.4 灰度值分析

显影完成后，应用Image J软件进行灰度值分析，以GAPDH为内参，计算分析c-Myc、p-c-M

Keywords: c-Myc; hematological malignant tumor; pr

32.Green TM, Young KH, Visco C, et al. Immunohistoche

35. Advani RH, Ansell SM, Lechowicz MJ, et al. A p