ANO1抑制剂对SHR大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及其机制探讨

摘要

目的： TMEM16A/Anoctamin-1（ANO1）是新发现的钙激活氯通道（calcium-activated chloride channel，CaCC)，在心血管组织有广泛的表达。在自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR），ANO1在血管组织和原代培养的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）表达明显增强，并参与血管功能和血压的调控。我们的前期实验发现：ANO1特异性抑制剂T16A(inh)-A01（A01）处理SHR-VSMC一天后，细胞增殖和迁移均被抑制。在此基础上，本研究进一步观察了ANO1抑制剂（A01）对VSMC增殖的抑制作用，并探讨了相关信号通路的变化。 内容和方法： 1.利用Western blot法检测SHR-VSMC上ANO1表达的变化。 2.将ANO1抑制剂A01分别加入SHR-VSMC和WKY-VSMC处理24h或72h，通过MTT法观察A01对细胞增殖的抑制作用。 3.将A01分别加入SHR-VSMC和WKY-VSMC处理24h，观察它对细胞增殖核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）蛋白水平的影响。 4.利用PI（碘化丙锭）染色法，观察A01对VSMC细胞周期的影响。 5.将A01加入SHR-VSMC和WKY-VSMC，观察A01对Erk通路的影响。 6.将A01加入SHR-VSMC和WKY-VSMC，观察A01对Akt通路的影响。 7.利用激光共聚焦显微镜及钙离子荧光染料，观察A01对细胞内钙水平的影响。 结果： 1.与WKY-VSMC相比，SHR-VSMC ANO1蛋白水平显著升高（P＜0.01）。 2.MTT结果显示：与WKY-VSMC对照组相比，SHR-VSMC的活细胞数目明显增多，生长速度明显加快（P＜0.01）。与SHR-VSMC对照组相比，1-5μM A01处理24h对细胞增殖的抑制作用不明显，但是10-20μM A01导致细胞的活细胞数目减少（P＜0.05）。A01（5-20μM）作用72h后，A01抑制细胞增殖的效应更加明显（P＜0.01）。A01作用24h和72h对WKY-VSMC的增殖均无明显影响。 3.与WKY-VSMC相比，SHR-VSMC的PCNA表达显著升高（P＜0.01）。A01（20μM）处理24h可部分抑制SHR-VSMC上PCNA的高表达（P＜0.05）。 4.利用流式细胞仪和PI染色发现：与WKY-VSMC相比，SHR-VSMC出现G1期比例下降的趋势，S期比例明显升高（P＜0.05）。A01（20μM）处理24h可导致SHR-VSMC的S期比例下降（P＜0.05）。但是在WKY-VSMC，A01的抑制作用并不明显。 5.通过检测Erk蛋白发现：WKY-VSMC加入A01（20μM）作用5-60min，p-Erk表达有所下降但是没有统计学意义。而在SHR-VSMC，20μM A01可明显抑制Erk的激活，最大效应出现在加药后30-60min（P＜0.01）。当以不同浓度A01（1-20μM）处理WKY-VSMC30min，p-Erk的表达并无明显改变，而10-20μM A01加入SHR-VSMC后，显著抑制了p-Erk的表达（P＜0.01）。以上结果提示A01抑制SHR-VSMC的Erk信号通路具有时间和剂量依赖性。 6.通过检测Akt蛋白发现：20μM A01加入SHR-VSMC处理5-60min，p-Akt的表达无明显变化。不同浓度A01加入SHR-VSMC孵育30min，p-Akt水平和对照组相比无明显差异。不同于Erk信号通路，Akt通路可能不参与A01对SHR-VSMC增殖的抑制作用。 7.利用激光共聚焦显微镜观察胞内Ca2+的荧光成像。结果显示：与WKY-VSMC相比，SHR-VSMC可记录到更加强的Ca2+荧光信号，而加入A01（20μM）后连续扫描2min，SHR-VSMC胞内的荧光强度明显降低（P＜0.05）但仍高于WKY-VSMC，提示A01能部分拮抗SHR-VSMC胞内钙的异常升高。 结论： 综上所述，ANO1抑制剂能明显抑制SHR-VSMC的异常增殖，该抑制作用可能与减少细胞周期中S期细胞比例，抑制Erk信号通路的激活以及降低胞内钙水平密切相关。

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学术硕士学位论文

1 实验动物

2 实验试剂

（9）Goat anti-rabbit IgG-HRP：Santa Cruz公司，货号：2004，1

（10）Goat anti-mouse IgG-HRP：Santa Cruz公司，货号：2005，1

（12）RIPA裂解液：碧云天生物技术有限公司，货号：P0013B

（13）蛋白上样缓冲液：碧云天生物技术有限公司，货号：P0015

（14）抗体稀释液：碧云天生物技术有限公司

（25）4×分离胶混合液：北京康为试剂生物科技有限公司

（26）5×上样缓冲液：碧云天生物技术有限公司

（27）4×浓缩胶混合液：北京康为试剂生物科技有限公司

（29）PVDF膜：Immoobilon-P，货号：IPVH00010

（30）胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）：BI公司

（31）DMEM高糖培养粉：Gibco公司

（32）胰蛋白酶（trypsin）：solarbio公司

（33）HBSS：Hyclone 公司

（34）青链霉素混合液：Solarbio公司

（35）四甲基偶氮唑盐（MTT）：Sigma公司

（36）二甲基亚枫（DMSO）：Bio sharp公司

（38）Fluo-3 AM：碧云天生物技术有限公司，货号：S1056

（39）水合氯醛：国药集团化学试剂有限公司

（40）氯化钠：Sigma公司

（41）葡萄糖：Sigma公司

（42）碳酸氢钠：天津市瑞金特化学品有限公司

（44）乙二醇双四乙酸（EGTA）：北京化工厂

（45）无水氯化钙（CaCl2 anhydrous）：Sigma公司

（46）无水硫酸镁（MgSO4 anhydrous）：Sigma公司

（47）氯化钾（potassium chloride, KCl）：Sigma公司

3 实验仪器

4. 主要溶液

5 VSMC的原代培养

6 VSMC的复苏、冻存及计数

7 MTT法检测活细胞数

8 Western blot

溶液成分

8%

10%

12%

15%

H2O

30%丙烯酰胺溶液

10%APS

分离胶缓冲液

TEMED

0.004

0.003

0.002

2%

3%

0.32

1.1

0.005

9 VSMC细胞周期检测

采用细胞周期试剂盒说明书进行测定。步骤如下：

（1）乙醇固定细胞：在15mL聚丙烯离心管中加入10ml 70%的乙醇，置于冰上待用。弃掉六孔板的培

10 VSMC胞内钙实验

0.25%胰酶消化细胞，显微镜下见细胞收缩稍变圆时，立即翻转培养瓶，吸净胰酶消化液，加入含胎牛血清的

11 统计学分析

应用GraphPad Prism 5.0统计软件进行统计学数据分析，结果以均数±标准误（X±SE）表

结果

1 ANO1在原代培养VSMC的表达

2 ANO1抑制剂A01对细胞增殖的影响

3 ANO1抑制剂A01对PCNA表达的影响

4 ANO1抑制剂A01对细胞周期的影响

5 ANO1抑制剂A01对Erk信号通路的影响

6 ANO1抑制剂A01对SHR-VSMC Akt信号通路的影响

7 ANO1抑制剂A01对胞内钙水平的影响

细胞以2×104个/孔密度在24孔板内爬片，培养24h后加入5μM Fluo-3AM孵育30min，

讨 论

参考文献

综 述

缩略词表