siRNA沉默FGF1基因表达对肺癌A549细胞侵袭性的影响及其机制研究

摘要

目的：肺癌作为当前高发恶性肿瘤，是导致全球癌症死亡病例的首要原因，其中非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）占肺癌总数的75%-80%。由于早期肺癌症状隐匿及不典型，多数患者诊断时已处于晚期，靶向治疗通过作用于特异性位点专一性杀伤肿瘤细胞，较过去放化疗有效改善了患者的生存率，且副反应较低。成纤维细胞生长因子1(fibroblast growth factor1,FGF1)是FGF家族成员之一，相关研究发现FGF1高表达与NSCLC原发病灶大小及血管侵袭性相关，且高表达FGF1患者总体生存率下降，但具体分子机制尚不清楚。本研究拟从细胞水平，研究应用小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）沉默FGF1基因表达对肺癌A549细胞侵袭性的影响及可能的分子机制。 方法：1、设计并合成带有荧光标签的FGF1的特异性siRNA即siRNA-1,siRNA-2、siRNA-3和空载体（NC-siRNA），将细胞分为5组：siRNA-1组，siRNA-2组，siRNA-3组，NC-siRNA组，对照组，分别转染5组细胞。转染48小时后，通过Western Blot技术分别检测5组A549细胞中FGF1蛋白表达量。选取降低最明显的siRNA-1作为后续实验的工具。2、后续实验将A549细胞分为3个实验组（对照组，NC-siRNA组，siRNA-1组），分别提取RNA、蛋白质，通过qRT-PCR和Western Blot技术分别检测3组细胞MMP-9、E-钙粘蛋白、N钙粘蛋白的mRNA及蛋白表达水平变化。3、应用流式细胞术测定3组细胞线粒体膜电位变化。4、应用Transwell实验测定3组细胞侵袭能力。 结果：1、siRNA沉默肺癌A549细胞FGF1基因48小时后，siRNA-1、siRNA-2组细胞FGF1蛋白表达水平与对照组相比显著降低（P＜0.001,P＜0.01,n=6），siRNA-3、NC-siRNA组细胞与对照组相比，FGF1蛋白表达水平无显著变化（P＞0.05,n=6）。2、siRNA-1组细胞与对照组相比，MMP-9蛋白及mRNA表达水平明显降低（P＜0.001，n=6），E-钙粘蛋白在蛋白及mRNA表达水平明显升高（P＜0.001,n=6），N-钙粘蛋白在蛋白及mRNA表达水平未见明显差异（P＞0.05,n=6）;NC-siRNA组细胞与对照组相比，MMP-9、E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白在蛋白及mRNA表达水平均无明显差异（P＞0.05,n=6）。3、应用流式细胞术观察到，与对照组相比，siRNA-1组细胞线粒体膜电位显著降低（P＜0.001,n=6），表明细胞凋亡比例升高；NC-siRNA组细胞线粒体膜电位较对照组未见明显差异（P＞0.05,n=6）。4、应用Transwell实验检测各细胞组侵袭性变化，siRNA-1组细胞与对照组相比，进入下层小室细胞数目明显减少（P＜0.001,n=6），反映细胞的侵袭能力下降；而NC-siRNA组较对照组未见明显变化（P＞0.05,n=6）。 结论:在NSCLC细胞中，采用siRNA特异性沉默FGF1基因后，FGF1蛋白表达降低，引起MMP-9表达下降，E-钙粘蛋白表达升高，细胞凋亡比例升高，最终降低肺癌A549细胞的侵袭能力，提示FGF1可作为未来NSCLC治疗的潜在靶标。

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