转HvNHX1基因枸杞植株的获得及耐盐性分析

摘要

土壤盐渍化严重影响植物的生长和发育，制约着当今农业生产的发展，提高作物的耐盐性已成为一个日益紧迫的研究课题。随着分子生物学的深入研究，发现液泡膜Na+/H+离子逆向转运蛋白将Na+区隔化在液泡，是植物抵御盐胁迫的主要方式之一，在植物耐盐方面起着非常重要的作用。目前国内外已有利用液泡膜Na+/H+离子逆向转运蛋白基因转化农作物，并获得的耐盐能力相对提高的转基因植株的文献报道。本研究利用基因工程手段将HvNHY1基因导入宁夏重要的经济作物枸杞中，提高枸杞耐盐能力，为提高枸杞产量、盐碱的改良和扩大利用提供了很好的途径。
　　 以枸杞叶片为外植体，优化出一套完整、高效的枸杞叶片再生体系。最佳的愈伤组织、不定芽诱导培养基为MS+NAA0.2mg/L+6-BA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L；最佳的分化培养基为MS+6-BA0.3mg/L+IAA0.8mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L；最佳的生根培养基为1/2MS+IBA0.6 mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖15g/L+琼脂7g/L；
　　 利用电击法，将重组质粒pSMNHX导入到根癌农杆菌LBA4404中，成功获得工程菌LBA4404-pSM-NHX。利用农杆菌介导法将HvNHX1基因导入到宁夏枸杞中，对转化体系进行优化，确定了最终的转化条件：抑菌剂替卡西林的较适浓度为200-300mg/L，卡那霉素较适浓度为50mg/L。农杆菌侵染浓度在OD0.4-0.6之间、侵染6min、共培养3d的转化效果最好。
　　 对侵染叶片进行再生培养，最终筛选出24株卡那霉素抗性枸杞，对其进行PCR检测，有9株显示阳性，转化率为38%。后对长势健康的6株阳性苗进行RT-PCR检测，结果表明HvNHX1已经成功整合到枸杞基因组中，并在RNA水平上得到表达。
　　 对转基因和非转基因植株进行NaCl胁迫试验，用NaCl(0%、0.7%、1.2%、1.5%)溶液浇灌10d后测定转基因枸杞和非转基因枸杞的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、丙二醛(MDA)、叶片Na原子含量等生理指标的变化，结果表明：盐胁迫处理后，转基因植株的SOD、POD活性均比对照高，且同一转基因植株在不同盐浓度下SOD、POD活性变化幅度较对照小，说明转基因植株对盐胁迫的耐受能力较强，受到的活性氧伤害较小。同浓度下，转基因植株的MDA含量要比非转基因植株少，表明转基因植株的受到的膜脂过氧化作用较弱，因此产生了比对照少的MDA。叶片Na原子含量测定结果表明：盐胁迫下转基因植株的Na原子含量随着盐浓度的增大而增加，非转基因枸杞的Na原子含量变化不大，说明由于外源基因的导入，使多余的Na+被区隔化在液泡中，从而减轻了盐离子对植株的伤害，一定程度上提高了植株的耐盐能力。
　　 综合分析得出：在盐胁迫下，转基因枸杞表现出较好的耐盐特性，初步证明HvNHX1基因的导入对枸杞的耐盐性有所提高。

目录

文摘

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中英文缩略词表

第一章 前言

1.1 盐分胁迫对植物的影响

1.2 植物的耐盐机制

1.3 Na+/H+逆向转运蛋白研究进展

1.4 枸杞

1.5 本研究的内容、目的及意义

第二章 枸杞叶片再生体系的优化

2.1 材料与试剂

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

第三章 HvNHX1基因对枸杞的遗传转化及分子检测

3.1 材料与试剂

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

第四章 转基因枸杞的耐盐性分析

4.1 材料与试剂

4.2 实验结果

4.3 结果与分析

4.4 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

附录

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