基于报告基因和干扰素-α信号通路的药物筛选

摘要

干扰素-α为目前国内外公认的抗病毒药物之一，但干扰素-α为蛋白多肽，存在体外易分解，体内易被代谢，不能口服等问题，因．此建立模型筛选具有干扰素-α样活性的有机小分子化合物，具有重要意义。新药发现是一个复杂和系统的工作，其中药物筛选模型的建立和先导化合物发现是新药研究的关键环节之一，本课题利用现代分子生物学和细胞生物学技术建立基于细胞的高效和灵敏的药物筛选模型，并利用所建立的药物筛选模型对有机小分子化合物进行了干扰素一0【样活性筛选，以期待发现具有新结构类型的拟干扰素一I)【样活性的有机小分子化合物。材料与方法 采用pTAL／SEAP载体，构建含有干扰素一0【刺激应答序列(interferonstimulated response element，ISRE)和报告基因的诱导性重组表达载体pTAL／ISRE—SEAP；采用脂质体的方法进行瞬时转染，将重组表达载体pTAL／ISRE--SEAP转染入血管内皮细胞(ECV304)和肝癌细胞(HepG2)中，确定用于稳定转染的细胞株；然后在瞬时转染的基础上，同时将阳性克隆筛选标记pTK—HygB和重组表达载体pTAL／ISRE-SEAP共转染ECV304，用潮霉素B筛选报告基因碱性磷酸酶(SEAP)表达受干扰素一a诱导的阳性克隆；并选取相关的细胞因子干扰素一B、干扰素一Y和生长因子甲状旁腺素(PTH)进行模型特异性考察；对模型的灵敏性、稳定性等进行评价；利用本模型对本实验室化合物库中的300个化合物进行了筛选；对于筛选出的258号化合物采用体外抗乙型肝炎病毒模型(HepG2．2．15细胞)及RT—PCR的方法进行作用机理研究。结果(1)重组表达载体酶切鉴定，确定成功构建了pTAL／ISRE—SEAP重组表达载体；(2)细胞转染，通过瞬时转染确定了ECV304细胞为稳定转染的细胞，并确定了转染条件；利用潮霉素B(500 μ g／ml)筛选出了稳定转染pTAL／ISRE-SEAP的阳性单克隆细胞；(3)模型考察，报告基因SEAP的表达受干扰素-α的诱导并呈现剂量依赖关系；干扰素-α的最高诱导表达率分别是IFN-β最高诱导表达率的9.0倍、IFN-γ的8.8倍和PTH的9.1倍，具有相对特异性；干扰素-a对ECV304细胞无增殖作用；本方法的Z'-因子为0.8；(4)化合物筛选，发现了具有激活干扰素-α信号通路的有机小分子化合物258号；258号化合物在体外抗乙型肝炎病毒模型上对s抗原和e抗原的分泌无明显影响，但对DNA拷贝数有抑制作用；RT-PCR实验结果显示258号化合物对OAS3基因的表达无影响。结论 本研究成功建立了基于报告基因和干扰素-α信号通路在细胞水平上的药物筛选模型，本模型具有SEAP高诱导表达；稳定性好；能用于微量化、高通量化、操作简便等特点。利用此模型在微孔板上用化学发光法测定SEAP基因的诱导表达水平筛选了300个化合物，筛选的样品次达400以上。发现258号化合物具有激活干扰素-α的信号通路的活性，具有一定体外抗病毒作用。

目录

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摘要

第一章前言

第二章立题依据

第三章试验材料与方法

第四章实验结果

第五章讨论

致谢

参考文献

附表附图

基于报告基因和干扰素-α信号通路的药物筛选模型的建立