肠溶包衣胰岛素-壳聚糖复合物纳米粒的研究

摘要

选择恰当的载体以提高胰岛素等蛋白多肽类药物口服给药的吸收度和生物利用度，一直是现代药剂学的研究热点和急需解决的难题。本论文以壳聚糖作为载体材料，通过离子交联法制备了肠溶包衣的胰岛素一壳聚糖复合物纳米粒(EICCN)。首先，考察了胰岛素与壳聚糖形成复合物的条件，并对两者的复合物进行了简单的鉴别；然后，对肠溶包衣胰岛素一壳聚糖复合物纳米粒的制备、理化性质和体外释药行为进行了评价；考察了制备纳米粒的影响因素；最后，考察了EICCN在正常和糖尿病大鼠体内的降糖作用，以及饮食情况、给药剂量、给药频率和酶抑制剂对降血糖效果的影响。 建立了胰岛素的HPLC分析方法，并进行系统适应性试验考察，结果表明在该色谱条件下，胰岛素在10～100 u g／mL浓度范围内线性关系良好，精密度、回收率、检测限和定量限均符合要求。 根据离子交联法的原理，制备了未复合的含胰岛素的壳聚糖纳米粒。通过正交设计试验，以粒径和包封率为评价指标优化其制备工艺，得到最佳处方为：壳聚糖浓度1.6mg／mL，胰岛素浓度0.64mg/mL，TPP浓度0.6mg/mL。对使用最优化处方制备的纳米粒的性质进行了初步考察，粒径为204nm，zeta电势为30.4mv，包封率为36.3％。还考察了壳聚糖脱乙酰度对纳米粒性质的影响，结果表明壳聚糖的脱乙酰度对胰岛素的包封率有显著影响，随着脱乙酰度的升高，胰岛素的包封率增高，纳米粒的粒径减小。 制备了胰岛素和壳聚糖的复合物，考察了影响两者复合反应的因素，并对形成复合物进行了初步鉴别。在影响因素之中，壳聚糖的脱乙酰度、壳聚糖溶液的pH值、壳聚糖与胰岛素的质量比以及两者的浓度对复合率均有不同程度的影响。对制备得到的胰岛素一壳聚糖复合物进行DSC和IR分析，DSC结果显示，复合物中胰岛素的吸热峰完全消失，表明胰岛素有可能与壳聚糖形成复合物；瓜分析结果表明，复合物中三个明显代表酰胺基团的特征峰：表征一NH伸缩振动的3365．0cm<’-1>峰、表征仲酰胺N-H弯曲振动的1575.8cm<’-1>峰以及表征C-N伸缩振动和N-H弯曲振动叠加的1409.2cm<’-1>峰均明显强于胰岛素、壳聚糖及两者的物理混合物。另外还有表征C=O伸缩振动的1654.6cm<’-1>峰，1575.8cm<’-1>峰可能是胰岛素的羧酸中的羟基与壳聚糖氨基形成仲酰胺时的吸收峰，这些均表明复合物中形成了大量的酰胺键。而且混合物中1081．8cm<’-1>处的C-O-H伸缩振动峰以及2959.5cm<’-1>处的羧酸中的O-H伸缩振动峰在复合物中均明显减弱，说明复合物中的羟基由于形成酰胺而大量减少；同时壳聚糖中3427.2cm<’-1>处的N-H伸缩振动峰以及混合物中619cm<’-1>处的N-H弯曲振动峰也在复合物中明显减弱，表明了壳聚糖中氨基的减少。上述结果均证明胰岛素与壳聚糖形成了复合物。 通过离子交联法和溶剂扩散挥发法制各了肠溶包衣胰岛素一壳聚糖复合物纳米粒，并对其制备工艺、影响因素、理化性质以及体外释药进行了考察。通过正交设计筛选出最佳处方组成为：壳聚糖浓度2mg／mL,壳聚糖溶液的pH值为6.0：胰岛素浓度为2.4mg／mL; TPP的加入体积为2mL制各过程中的重要影响因素有壳聚糖的脱乙酰度、胰岛素溶液的酸碱度、表面活性剂的种类和浓度、搅拌速度、复合时间、肠溶材料的种类、浓度、使用的溶剂系统以及冻干支持剂的种类和用量等等。最终得到流动性较好地白色粉末，通过电子扫描显微镜可看到，冻干物中有大量的颗粒，表面沉积较厚的甘露醇，颗粒的球形度较好，分散包埋在甘露醇粉末之中。形成复合物后，胰岛素纳米粒的释药速率降低，突释现象明显减弱。EICCN 在酸性介质中的释药速率显著低于未包衣和未复合纳米粒。随着壳聚糖脱乙酰度的升高，胰岛素的释放速率加快，随着粒径的增大，胰岛素的释放速率降低。ICCN和EICCN在酸性和碱性介质中的释放基本符合Hi~uchi扩散模型或Baker-Lonsdale球形扩散模型。分别考察了EICCN在正常和糖尿病模型大鼠体内的降血糖作用，并考察了饮食情况、给药剂量、给药频率以及酶抑制剂对其降糖效果的影响。在禁食正常大鼠体内，形成复合物的胰岛素纳米粒的降血糖效果明显强于未复合的胰岛素纳米粒。复合物纳米粒肠溶包衣以后，降血糖效果进一步增强。口服ICCN和EICCN 24小时相对于皮下注射给药的生物利用度分别为7.09％和8.67％。EICCN对禁食的正常大鼠具有明显的降血糖作用，且降血糖效果与剂量呈正相关。EICCN 在正常大鼠正常饮食条件下的降血糖作用明显强于未包衣纳米粒，能够更有效地抑制进食所引起的血糖浓度的升高。在禁食糖尿病模型大鼠体内ICCN 和EICCN的24小时相对生物利用度(与皮下注射比)分别为11.19％和16.29％。正常饮食糖尿病模型大鼠单剂量口服给予胰岛素壳聚糖复合物纳米粒后，进食引起的血糖浓度的升高明显受到抑制。EICCN对血糖浓度升高的抑制作用明显强于ICCN。正常饮食的正常大鼠，多剂量给药后各组动物血糖浓度的降低效果比单剂量给药明显增强，所有受试胰岛素制剂的降血糖效果均与给药次数呈正相关。皮下注射给药的降糖效果最为显著，EICCN的降糖效果明显强于ICCN，能够将动物血糖浓度控制在较低的水平。口服给予EDTA作为酶抑制剂能够显著增强ICCN和EICCN的降糖作用。无论是单剂量还是多剂量，联合EDTA给药，EICCN都能够更显著的抑制动物血糖浓度的升高，尤其是多剂量给药，口服EICCN可以将模型大鼠的血糖浓度控制在较低的水平。 综上所述，肠溶包衣胰岛素-壳聚糖纳米粒具有较高的包封率，有效地抑制了胰岛素的突释，并且在正常和糖尿病模型大鼠体内均表现出显著的降血糖作用，尤其是多剂量给药，能够有效地抑制进食所引起的血糖浓度的升高。本制剂可以作为胰岛素口服给药的有效的载体。 本论文的几个特点：1)采用生物可降解的、无毒、具有生物粘附性的高分子材料，通过离子交联法制备纳米粒，方法简单，条件温和。2)将胰岛素与壳聚糖形成复合物，以提高包封率、降低突释并提高生物利用度。该制备方法在国内未见报道。3)将胰岛素一壳聚糖复合物纳米粒进行肠溶包衣，避免纳米粒在胃酸中被破坏所引起的药物泄漏，有助于提高生物利用度4)在动物体内降糖作用研究中，为了模拟糖尿病患者现实情况，考察了正常饮食情况对本制剂降糖作用的影响，以期为进一步的药效学研究和最终的临床用药奠定基础。该研究在国内外未见报道。

目录

摘要

前言

第一章胰岛素—壳聚糖复合物的制备与研究

第二章肠溶包衣胰岛素—壳聚糖复合物纳米粒的制备与研究

第三章肠溶包衣胰岛素—壳聚糖复合物纳米粒的在大鼠体内的降糖作用研究

1.仪器与试药

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

5.本章小结

6.参考文献

附表

全文结论

致谢

攻读博士学位期间投稿及发表论文情况