鼠伤寒沙门氏菌菌毛FimA与PefA蛋白的原核表达及纯化

摘要

沙门氏菌病又名副伤寒。有些沙门氏菌血清型可以引起牛沙门氏菌病。目前由于抗生素的长期滥用导致沙门氏菌耐药性普遍存在，不仅影响该病的防治，更对公共卫生造成威胁。随着规模化、集约化舍饲养牛方式的不断发展，牛沙门氏菌病成为阻碍其健康发展和影响食品安全的一个因素。
　　沙门氏菌Ⅰ型菌毛无论是在菌毛装配上还是在基因、氨基酸序列方面，都较为保守。fimA是编码Ⅰ型菌毛主要的菌毛亚单位。菌毛Pef具有良好的特异性。pefA为其主要的菌毛亚单位。本试验通过传统检测方法对宁夏地区牛源沙门氏菌进行分离鉴定并确定了沙门氏菌的优势血清型;然后探索四对特异性引物用于PCR快速检测的可行性;最后利用原核表达的方法得到纯化的鼠伤寒沙门氏菌上述两种菌毛主要亚单位蛋白，以期望在后续的抗原性分析、诊断以及预防鼠伤寒沙门氏菌病提供参考依据。基于上述研究内容作了以下三个方面的工作:
　　1宁夏地区牛源沙门氏菌的分离鉴定
　　为了分析宁夏地区引起奶牛临床乳房炎、隐性乳房炎、犊牛腹泻、成母牛流产的病原体。本试验通过采集病料，利用一系列微生物诊断方法和分子生物学方法对样品中沙门氏菌进行分离鉴定。结果表明四种特异性引物PCR扩增结果与预期一致，可以用于后续沙门氏菌PCR快速检测的建立。627份病牛样品中有33份鉴定为沙门氏菌，分离率为5.26％。乳样中检出7种沙门氏菌血清型，组织样中检出2种沙门氏菌血清型，均为我国常见血清型。其中鼠伤寒沙门氏菌为优势血清型，其次为纽波特沙门氏菌。
　　2鼠伤寒沙门氏菌菌毛FimA、PefA蛋白的原核表达
　　为了获得鼠伤寒沙门氏菌菌毛FimA、PefA的重组蛋白。本阶段试验首先对两种菌毛亚单位进行B细胞表位分析，设计并合成引物，通过PCR技术扩增目的基因。利用T4连接酶构建重组质粒。将构建好的重组质粒导入到大肠杆菌中，并对诱导条件（IPTG浓度、诱导时间）进行优化。最后利用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式。结果表明两种重组载体全部构建成功，重组蛋白全部表达。两种重组蛋白FimA、PefA相对分子质量分别约为36kDa、33kDa且与预期一致，说明表达的蛋白是目的蛋白。重组蛋白FimA和PefA在大肠杆菌内部积累，FimA蛋白主要以包涵体形式存在，而PefA蛋白主要以可溶形式存在。
　　3菌毛亚单位蛋白FimA、PefA的纯化
　　为了进行后续的抗原性分析需要纯化的重组蛋白FimA、PefA。利用Ni-Agarose Resin分离纯化FimA、PefA重组蛋白。利用Western blot对纯化的FimA、PefA重组蛋白进行分析。蛋白电泳和Western blot都显示为一条清晰的蛋白条带。结果显示它们的大小分别约为36 kDa、33 kDa。本试验获得纯度较高的重组蛋白FimA、PefA可以为进一步抗原性分析以及研发鼠伤寒沙门氏菌的疫苗和检测提供原材料。

目录

声明

论文说明

摘要

英文缩略词表

第一章 文献综述

1．1 沙门氏菌属的分类

1．2 沙门氏菌的检测方法

1．3 沙门氏菌的致病性

1．4 沙门氏菌菌毛

1．5 菌毛和生物膜之间的关系

1．6 菌毛和宿主的关系

1．7 研究目的及意义

第二章 宁夏地区牛源沙门氏菌的分离鉴定

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果

2．4 分析与讨论

第三章 鼠伤寒沙门氏菌菌毛FimA与PefA蛋白的原核表达

3．1 材料

3．2 方法

3．3 结果

3．4 讨论

第四章 菌毛蛋白FimA、PefA的纯化

4．1 材料

4．2 方法

4．3 结果

4．4 讨论

第五章 结论

参考文献

附录

致谢

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