发状念珠藻水分胁迫蛋白(WspA)体外分子定向进化及其功能分析

摘要

发状念珠藻，俗称发菜，是一种陆生固氮蓝藻。发状念珠藻具有极强的耐旱能力，体内蕴藏着丰富的耐旱特异基因资源，是研究耐旱基因的理想材料。克隆和研究其耐旱相关基因，将为植物抗旱基因工程提供候选功能基因或理论借鉴。WspA蛋白最早分离于地木耳，具有一定的耐旱功能，并伴有β-半乳糖苷酶活性。研究表明在发状念珠藻胶质鞘中存在多种WspA同源蛋白，这可能是具鞘类念珠藻特有的一类蛋白。
　　本研究以发状念珠藻基因组DNA为模板，利用PCR技术克隆得到两个发状念珠藻水分胁迫蛋白基因序列，并命名为Wsp3和WspA4。通过生物信息学分析，发现该类蛋白属于亲水酸性蛋白，分布在细胞质中。将WspA3及WspA4基因与表达载体pET-32a连接构建重组表达载体并将其转化至大肠杆菌BL21中进行原核表达。以聚乙二醇6000(PEG6000)对其进行模拟干旱胁迫，发现其最高可耐60％PEG6000胁迫，表现出较强的耐旱能力。
　　为提高发状念珠藻WspA3蛋白与WspA4蛋白在干旱条件下促进宿主细胞生长的能力，采用易错PCR的方法向WspA蛋白基因序列中引入碱基突变，转化大肠杆菌BL21中构建突变基因表达文库，以60％PEG6000模拟干旱胁迫下突变子的工程菌生长情况为指标进行微孔板筛选，最终获得耐旱性能增强的6个蛋白，其中进化的WspA3蛋白2个，进化的WspA4蛋白4个，检测进化蛋白的β-半乳糖苷酶相对比活力，其酶相对比活力是野生型蛋白酶相对比活力的1.4-3.5倍。通过基因家族改组对6个进化蛋白改造，没有得到耐旱功能增强的突变蛋白序列，但其表型有明显的变化，说明此次家族改组对进化蛋白的改进起到一定的推动作用。
　　将WspA3、WspA4及WspA3-sf1、WspA4-sf1基因转入高等模式植物烟草中超表达，研究WspA3-sf1、WspA4-sf1基因的潜在耐旱功能。成功获得转WspA3、WspA4及WspA3-sf1基因烟草，对转基因烟草进行5天10％PEG6000模拟干旱胁迫处理。转基因烟草中的抗氧化酶类活性较对照增高，丙二醛含量较对照下降，表明该基因参与了干旱胁迫下烟草抗氧化酶系的调控及膜稳定性调节物质的积累。转WspA3-sf1基因烟草生理指标变化更加突出，表明该基因具有更强的耐旱能力。

目录

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摘要

中英文缩略词(Abbreviation Table)

第一章前言

1．1发状念珠藻形态及生态学意义

1．2发状念珠藻耐受干旱胁迫的机制

1．3水分胁迫蛋白相关研究

1．4蛋白质体外分子定向进化研究概况

1．5论文研究背景

1．6论文研究内容及技术路线

第二章WspA基因的克隆及其功能研究

2．1实验材料

2．2实验方法

2．3结果与分析

2．4讨论

第三章WspA蛋白体外分子定向进化研究

3．1实验材料

3．2实验方法

3．3结果与分析

3．4讨论

第四章WspA基因转化烟草的研究

4．1实验材料与试剂

4．2实验方法

4．3结果分析

4．4讨论

5．1结论

5．2创新性

5．3展望

参考文献

致谢

附录

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