水飞蓟宾对异丙肾上腺素引起大鼠乳鼠心肌细胞损伤及凋亡的保护作用及其机制研究

摘要

本文系统地研究了水飞蓟宾体外抗心肌细胞凋亡的分子机制，着重阐述了在D．肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素诱导的大鼠乳鼠心肌细胞凋亡过程中，水飞蓟宾保护作用的分子机理。 凋亡失控是许多疾病(如自身免疫性疾病、心血管疾病与神经退行性病变等)的发病原因之一。在研究中我们发现从植物水飞蓟(Silybum marianum)的果实和种子中提取得到的一种多酚羟基黄酮类化合物-水飞蓟宾，具有抗异丙肾上腺素诱导的大鼠乳鼠心肌细胞细胞凋亡的活性。 研究发现，用MTT法测定细胞存活率，酶联法测定细胞丙二醛(maleicdialdehyde，MDA)和细胞培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)的含量来衡量心肌细胞的损伤程度，与异丙肾上腺素作用组相比，水飞蓟宾使细胞受损伤的程度降低，并且增加SOD的活性，降低[Ca<'2+>]i，抑制了细胞膜电位的降低，并且抑制了细胞色素c由线粒体释放到胞浆中，改善Bcl-2家族蛋白中促凋亡蛋白Bax与抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达比率，上调Bax上游抗凋亡性去乙酰化酶SIRT1蛋白的表达，改变Bax蛋白在线粒体和胞浆内的分布。DNA凝胶电泳、TUNEL与Hoechst33258染色实验结果均证明异丙肾上腺素引起心肌细胞DNA的损伤，呈现细胞凋亡的特征，水飞蓟宾可逆转异丙肾上腺素的作用，并且降低由异丙肾上腺素引起的细胞内NO的升高，减少iNOS的表达。水飞蓟宾抑制前体caspase-3剪切为其活性形式，由此阻止了其对下游底物ICAD(inhibitorof caspase activated DNase)及PARP(poly-(ADP-ribose)polymerase)蛋白的消化。调节细胞周期或细胞凋亡的蛋白p53在异丙肾上腺素的作用下增多，并且活化为磷酸化p53，水飞蓟宾减少了p53及其磷酸化形式的表达，而p53下游，参与调节细胞周期的p21蛋白在整个过程中没有变化，流式细胞仪检测结果显示心肌细胞的周期没有改变，因此推测p53在此过程中发挥促细胞凋亡的作用。位于上游的酪氨酸激酶途径参与了水飞蓟宾的抗心肌细胞凋亡作用，促进细胞增殖的Ras、Raf-1在水飞蓟宾的作用下表达量增加，并且依赖于PKC(蛋白激酶C)蛋白的活力，MAPK家族中ERK蛋白活化为其磷酸化形式参与细胞保护作用，而p38的作用与此相反，JNK蛋白在此过程中没有变化，并且ERK与P38的磷酸化必须有PKC、Ras与Raf-1的作用。连接酪氨酸激酶与线粒体的P13K/Akt也参与了水飞蓟宾的抗凋亡作用，并且Akt/PKB(蛋白激酶B)通过转录依赖型和非依赖型机制影响下游的蛋白。Akt通过磷酸化IκBα(inhibitor protein of nuclearfactor κB)使之降解或者直接作用，促进核转录因子NF-κB由胞浆转位到细胞核，调节抗凋亡基因的转录，Akt抑制p53的核转位，使p53在胞浆中被泛素化降解。并且Akt使线粒体下游的促凋亡蛋白caspase-9失活不发挥其促凋亡作用，并且对死亡受体途径中的FasL的表达也发挥抑制作用。综上所述，水飞蓟宾能有效地缓解异丙肾上腺素引起的心肌细胞损伤，抑制异丙肾上腺素诱导的细胞凋亡。

目录

论文说明:缩略语说明

声明

摘要

第一章 绪论

第一节 心肌细胞凋亡与心脏疾病的关系

一、心脏疾病中的心肌细胞凋亡

二、研究心肌细胞凋亡的意义

第二节 细胞调亡及分子机制研究进展

一、细胞凋亡的特征

二、细胞凋亡的一些调控因素

三、细胞凋亡的信号转导途径

第三节 水飞蓟的化学成分及药理学研究进展

参考文献

第二章 水飞蓟宾对异丙肾上腺素引起的大鼠乳鼠心肌细胞损伤的保护作用及其机制研究

第一节 大鼠乳鼠心肌细胞损伤模型的建立

一、实验部分

二、实验结果

三、讨论

第二节 水飞蓟宾保护由异丙肾上腺素引起的大鼠乳鼠心肌细胞损伤的作用机制研究

一、实验部分

二、实验结果

三、讨论

四、小结

参考文献

第三章 水飞蓟宾抗异丙肾上腺素引起大鼠心肌细胞凋亡的机制研究

第一节 水飞蓟宾对DNA损伤保护作用的研究

一、实验部分

二、实验结果

三、讨论

四、小结

第二节 酪氨酸激酶途径及其相关蛋白在水飞蓟宾抗凋亡过程中的作用

一、实验部分

二、实验结果

三、讨论

四、小结

第三节 AKT及相关蛋白在水飞蓟宾抗凋亡中的作用

一、实验部分

二、实验结果

三、讨论

四、小结

参考文献

致谢

附录