pAKt、pmTOR及HIF-1α在脑梗死大鼠脑组织的表达及水飞蓟宾对缺血性脑组织的神经保护作用

摘要

目的：缺血性脑血管疾病是常见病和多发病，其病死率高、致残率高、复发率高、花费高。脑组织缺血后继而发生的脑组织损伤是一系列十分复杂的级联式的病理反应，主要包括炎症反应、细胞凋亡、氧化应激及细胞内钙超载等等。在急性脑梗死后的缺血乃至坏死的脑组织区域中存在着大量的过度的炎症免疫反应，从而引起炎症介导的脑组织损伤，减轻炎症反应介导的损伤是治疗脑梗死后继发性脑损伤的主要措施之一。细胞凋亡的具体调节机制目前虽然不很清楚，但是近期的实验以及临床研究显示：抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax两者的平衡在细胞凋亡过程中发挥了至关重要的作用。目前，抗炎与抗凋亡治疗在脑梗死的临床应用研究中还没有取得理想的预期效果，而通过探索级联反应上游的始动因子并加以药物干预就有望成为治疗脑梗死的有效途径。Akt/mTOR/HIF-1α信号转导通路通过调节细胞周期、蛋白质合成与降解、细胞能量代谢等多种途径发挥着重要的生理功能，在细胞增殖、生长、分化以及凋亡等过程中起着重要作用。该通路诱导的核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信号通路激活以及Bcl-2与Bax的平衡调节在缺血性脑血管疾病引起的神经系统炎症免疫反应与凋亡中发挥着重要的作用。水飞蓟宾(Silibinin)是从菊科药用植物水飞蓟种子的种皮中提取所得的一种黄酮木脂素类化合物，大量的实验研究发现其具有抗炎、抗凋亡以及抗肿瘤等多种药理作用，但其具体作用机制并不十分明确。本实验在大鼠永久性大脑中动脉闭塞(middlecerebral artery occlusion，MCAO)所致的脑缺血模型上观察局部脑缺血后水飞蓟宾的神经保护作用及其可能的机制。
　　方法：成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠，随机分为假手术组(Sham)、对照组(Vehicle)、水飞蓟宾大剂量组(Silibinin100mg/kg per day，Silibinin-H)、水飞蓟宾小剂量组(Silibinin50mg/kg per day，Silibinin-L)、正常对照组(Normal)。应用改良的Longa线栓法建立大鼠右侧MCAO模型。药物干预组动物梗死前30分钟灌胃给予50 mg/kg或100 mg/kg的水飞蓟宾。以后每天给药一次。Vehicle组、Sham组和Normal组给予等容量生理盐水。术后24 h和72 h对大鼠进行神经功能评分。评分完毕将动物断头处死，用干湿重法测定脑组织含水量，用2％2，3，5-三苯基四唑氮红(triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色法测算脑梗死体积，用免疫组化、免疫印记(Western Blot)和逆转录多聚酶链反应(ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)来观察Akt，phosphorylated Akt(pAkt)，mTOR，phosphorylated mTOR(pmTOR)，HIF-1α，Bcl-2，Bax，NF-κB及claudin-5的表达情况。
　　结果：
　　1 Sham组无神经功能缺损，而Vehicle组、水飞蓟宾小剂量组和水飞蓟宾大剂量组大鼠均出现不同程度的左侧肢体偏瘫。水飞蓟宾大剂量组的神经功能评分在24 h和72 h均低于Vehicle组，差异有统计学意义(P＜0.05)。水飞蓟宾小剂量组与Vehicle组相比，神经功能评分有所改善，但差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　2与Vehicle组相比，水飞蓟宾小剂量组病变侧脑组织含水量在72 h时降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。水飞蓟宾大剂量组与Vehicle组相比，病变侧脑组织含水量在24 h和72 h时均显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　3水飞蓟宾大剂量组脑梗塞体积在24 h时明显小于Vehicle组，差异有统计学意义(P＜0.05)。水飞蓟宾小剂量组脑梗塞体积虽有所减小，但与Vehicle组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　4与Normal组相比，脑缺血24 h和72 h后pAkt，pmTOR，HIF-1α阳性细胞数目增多，pAkt，pmTOR，HIF-1α蛋白表达以及Akt，mTOR mRNA表达均增多，具有统计学意义(P＜0.05)，而HIF-1α在mRNA水平的表达无统计学意义(P＞0.05)。
　　5水飞蓟宾上调pAkt，pmTOR，HIF-1α的表达。脑缺血后，缺血灶周围脑组织pAkt，pmTOR，HIF-1α阳性细胞数、蛋白水平以及mRNA(除外HIF-1α的mRNA水平表达)表达水平均上升，给予水飞蓟宾后，大剂量组较Vehicle组pAkt，pmTOR，HIF-1α表达量明显增多(P＜0.05)，水飞蓟宾小剂量组无明显变化(P＞0.05)。
　　6与Vehicle组相比，水飞蓟宾大剂量组在蛋白水平和mRNA水平上调Bcl-2，下调Bax、NF-κB的表达，差异有统计学意义(P＜0.05)，水飞蓟宾小剂量组与Vehicle组相比，结果无统计学意义(P＞0.05)。
　　7水飞蓟宾可以改善血脑屏障的通透性。与Sham组相比，脑缺血后claudin-5表达显著下降。Western Blot以及RT-PCR均显示水飞蓟宾大剂量组可以上调缺血后脑组织内claudin-5的表达(P＜0.05)，小剂量组则无此效果(P＞0.05)。
　　结论：pAkt，pmTOR，HIF-1α在脑缺血后脑组织中表达显著升高，水飞蓟宾可以明显改善大鼠脑梗死后神经功能损伤、减轻脑水肿、减轻脑梗塞体积，其作用可能与上调pAkt，pmTOR，HIF-1α，Bcl-2，下调Bax，NF-κB，从而发挥抑制炎症反应、抗凋亡作用；同时水飞蓟宾可以上调claudin-5，改善血脑屏障的通透性。