硫酸盐还原分离菌APS还原酶和亚硫酸盐还原酶的纯化及性质研究

摘要

APS还原酶和亚硫酸盐还原酶是硫酸盐还原菌(SRB)硫酸盐代谢途径中的关键酶，本研究从来源于烟气生物脱硫系统的厌氧磁性稳态流化床反应器(anMSFB)中取磁性多孔珠固定化生物膜，采用硫酸盐还原菌培养基严格按Hungate的厌氧操作技术,以10倍稀释法进行滚管培养，以亚铁盐为菌落选择指示剂，经富集培养、反复分离纯化获得纯分离物。该分离物采用伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)方法进行鉴定。根据形态和生理生化特性，初步鉴定分离菌属于脱硫弧菌属，种名为普通脱硫弧菌Desulfovibrio vulgaris；对分离菌产APS还原酶和亚硫酸盐还原酶的发酵条件进行了优化，其结果为：发酵最佳初始pH值为7，最佳培养温度为35℃，摇床培养72h后达产酶高峰；分离菌粗提液通过盐析、DEAE-52柱层析得到APS还原酶和亚硫酸盐还原酶两个活性峰。 APS还原酶活性峰经Sephadex G-150凝胶层析得到APS还原酶：纯化倍数为116，酶比活力为70.17 U/mg，活性回收率为18.36％，电泳分析为单一条带，达到了电泳纯。酶学性质研究表明该酶的酶催最适温度和pH分别为30℃和pH 7.8，在pH 4～10、温度20～70℃之间均具有较好的稳定性，残余酶活都在60％以上；还原产物AMP和SO32-对APS还原酶产生抑制，而ATP、ADP、cAMP、GTP、cGMP和乙酰辅酶A对APS还原酶的活力影响很小；该酶对其底物Na2SO3和K3Fe(CN)6的Km(Na2SO3)、Vmax和Km(K3Fe(CN)6)、Vmax分别为2.32mmol/L、11.81U/mL和2.43mmol/L、11.71U/mL；SDS-PAGE凝胶电泳表明APS还原酶分子由分子量为29.4 KDa和66.7 KDa的两个亚基构成，属αβ异二聚体；光谱分析表明该酶分子结构中含有一分子FAD和两个[4Fe-4S]簇；反应计量关系分析表明该酶电子受体APS与电子供体细胞色素c3之间的反应摩尔比为2:1。 亚硫酸盐还原酶活性峰经 Sephadex G-150 凝胶层析得到亚硫酸盐还原酶：酶比活力为79.34U/mg，纯化倍数为132，活性回收率为19.8％，电泳分析为单一条带，达到了电泳纯。以亚硫酸钠为底物，对亚硫酸盐还原酶的酶学性质进行了研究，结果表明：该酶反应的最适温度和pH分别为34℃和pH 7.6，酶在pH4～10、温度20～70℃之间均具有较好的稳定性，残余酶活都能保持在70％以上；金属离子Ca2+、Co2+、Cu2+和Hg2+对该酶具有明显的抑制作用，Zn2+、Mn2+对该酶有轻微的抑制作用，其他离子在实验浓度范围内对该酶酶活无明显影响。PCMB和KCN能强烈抑制亚硫酸盐还原酶的活性，连二亚硫酸盐、金属离子鳌合剂EDTA、蛋白酶抑制剂PMSF和IAA对该酶活性有轻微的抑制作用，叠氮化钠对酶活无抑制；该酶对底物Na2SO3的Km为2.06mmol/L，Vmax为11.82U/mL；SDS-PAGE表明该酶分子是由分子量为32.3 KDa和43.6KDa的两个亚基构成的αβ异二聚体；光谱分析表明亚硫酸盐还原酶的分子结构中含有[4Fe-4S]簇和具卟啉的亚铁血红素。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1硫酸盐还原菌的生物学特性与应用研究

1.1.1硫酸盐还原菌的概述

1.1.2硫酸盐还原菌的分类学地位

1.1.3硫酸盐还原菌的硫酸盐还原代谢机理

1.1.4硫酸盐还原菌的应用

1.2硫酸盐还原菌硫还原途径中的酶学研究进展

1.2.1 APS还原酶研究进展

1.2.2亚硫酸盐还原酶研究进展

1.2.3其他关键酶类的研究概况

1.3论文研究的内容及意义

2实验部分

2.1材料、仪器与试剂

2.1.1实验材料

2.1.2主要仪器和设备

2.1.3主要试剂

2.1.4主要溶液

2.2分离菌产酶发酵条件的优化

2.2.1菌株产酶最适温度的测定

2.2.2菌株产酶最适PH值的测定

2.2.3菌株产酶高峰期的测定

2.3分离菌APS还原酶及亚硫酸盐还原酶的分离纯化

2.3.1分离菌的培养

2.3.2分离菌粗提液的制备

2.3.3盐析分离

2.3.4层析分离

2.3.5酶活力分析

2.3.6蛋白含量的测定

2.3.7酶纯度鉴定

2.4分离菌APS还原酶及亚硫酸盐还原酶的性质表征

2.4.1最适温度和最适pH

2.4.2热稳定性和酸碱稳定性

2.4.3酶的动力学性质

2.4.4底物专一性和电子受体

2.4.5酶的激活剂和抑制剂

2.4.6酶分子量的确定

2.4.7 UV/可见光谱扫描分析

3实验结果及分析讨论

3.1硫酸盐还原菌产酶发酵工艺条件的确定

3.1.1菌株产酶最适温度

3.1.2菌株产酶最适PH

3.1.3菌株产酶高峰期

3.2 APS还原酶及亚硫酸盐还原酶的分离纯化

3.2.1盐析最佳硫酸铵饱和度的选择

3.2.2 DEAE-52纤维素离子交换层析

3.2.3 Sephadex G-150凝胶过滤层析

3.2.4分离纯化实验结果

3.2.5讨论

3.3酶的纯度鉴定及分子量测定

3.3.1 APS还原酶的纯度鉴定及分子量测定

3.3.2亚硫酸盐还原酶的纯度鉴定及分子量测定

3.4酶的光谱性质

3.4.1 APS还原酶的光谱性质

3.4.2亚硫酸盐还原酶的光谱性质

3.5酶的最适pH和最适温度

3.5.1酶的最适pH

3.5.2酶的最适温度

3.6酶的酸碱稳定性和热稳定性

3.6.1酶的酸碱稳定性

3.6.2酶的热稳定性

3.7酶的最大反应速度及米氏常数

3.7.1亚硫酸盐还原酶的最大反应速度及米氏常数

3.7.2 APS还原酶的最大反应速度及米氏常数

3.8酶的底物专一性和电子受体分析

3.8.1亚硫酸盐还原酶的底物专一性分析

3.8.2 APS还原酶底物APS与cytc3的反应计量关系分析

3.9核苷酸类辅酶和亚硫酸根对APS还原酶的影响

3.10金属离子及抑制剂对亚硫酸盐还原酶的影响

4.结论与创新

4.1主要研究结论

4.2创新点

4.3本研究有待深入的内容

参考文献

作者在读期间发表论文：

致谢