酵母双杂交筛选与HCV F蛋白相互作用的基因及F蛋白的表达的研究

摘要

人类于1989年成功分离得到丙型肝炎病毒(HCV)，HCV以其高传染性和对肝组织严重的破坏性引起了各国科学工作者的广泛关注。在他们的共同努力下，人类对HCV的生活史和基因表达产物有了比较全面的认识，为进一步揭示HCV病理学过程，寻找治疗方法和研发新药奠定了坚实的基础。然而，HCV的秘密并没有完全呈现在人们面前。2001年美国南加州大学的研究小组报道：新发现位于HCv核基因区内有一个16-17kd的F蛋白，编码该蛋白的基因与HCV核基因序列有部分重叠。该蛋白是由于核糖体移码突变产生的，并且广泛存在于HCV的多个亚型。F蛋白的确切功能尚不清楚，但有报道显示F蛋白可以下调p21的转录活性，F蛋白对人类认识HCV以及最终攻克HCV具有潜在的重要意义。 HCV的F蛋白是HCV核基因(core gene)移码突变的产物。本研究采用酵母双杂交技术，筛选与F蛋白相互作用的蛋白基因，间接推测F蛋白可能具有的生物学功能。通过构建F蛋白诱饵质粒，转化酵母AH109后，与含肝脏cDNA文库质粒的酵母SFY526进行配合，在涂有X-α-gal营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长。挑选蓝色克隆提取其质粒，电转化大肠杆菌Top10后，取大肠杆菌阳性克隆进行测序，并在Gene Bank比对分析。得到5个与F蛋白特异性相互作用的基因克隆：APOH，C8B，HP，RBP4，EEF2。 此外，为了了解F蛋白的表达情况，将F蛋白分别在大肠杆菌表达菌株BL21和人T293细胞进行了原核和真核表达，来初步了解F蛋白的表达情况。通过对F蛋白的基因及蛋白序列进行生物信息学分析，对其抗原表位和可能具有的二级结构进行了预测，为F蛋白进一步研究进行了有意义的探索。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：插图和附表清单、缩略语表

声明

1引言

1.1丙型肝炎病毒的概述

1.1.1 HCV的发现

1.1.2 HCV生活史和基因表达产物

1.1.3 HCV编码的关键蛋白酶

1.1.4 HCV RNA复制的机制

1.2 F蛋白的概述

1.2.1 HCV基因组中开放的读码框的发现

1.2.2编码框ARF的概述

1.2.3 F蛋白的发现

1.2.4 F蛋白的表达

1.3酵母双杂交系统的建立与发展

1.3.1酵母双杂交的原理

1.3.2酵母双杂交的发展

1.3.3酵母双杂交系统的应用

1.4研究内容和目标

1.4.1研究内容

1.4.2研究目标

2对F蛋白基因突变位点的修复

2.1材料与方法

2.1.1材料与试剂

2.1.2实验方法

2.2结果与分析

3 F基因表达载体的构建

3.1材料与方法

3.1.1材料与试剂

3.1.2实验方法

3.2结果与分析

3.2.1 PCR扩增F片断

3.2.2 双酶切鉴定结果

4酵母双杂交系统筛选与F蛋白相互作用的基因

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2实验方法

4.2结果与分析

4.2.1 Western Blot检测pGBKT7-F在酵母中的表达结果

4.2.2酵母双杂交的颜色反应结果

4.2.3 PCR鉴定筛选基因的结果

4.2.4测序筛选基因

5 F蛋白原核与真核诱导表达

5.1材料与方法

5.1.1材料

5.1.2实验方法

5.2结果与分析

6 F蛋白的生物信息学抗原表位分析

6.1材料与方法

6.1.1材料

6.1.2实验方法

6.2结果分析

6.2.1 F蛋白的抗原表位结果

6.2.2 F蛋白二级结构预测

7结论

8讨论

9展望

致谢

参考文献

附录

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