乳糖酶基因在毕赤酵母中的表达鉴定、发酵工艺优化及发酵液后处理的研究

摘要

β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactoside galactohydrolase，EC 3.2.1.23)通常被称为乳糖酶(Lactase)。该酶可将乳糖水解成为半乳糖与葡萄糖，同时也具有半乳糖苷的转移作用。β-半乳糖苷酶主要应用在生产低乳糖乳制品以及缓解绝大多数亚洲人食用乳制品时造成的乳糖吸收不良和乳糖不耐受的问题。但目前在我国乳糖酶的应用还未得到广泛推广，主要原因就是乳糖酶产量低，销售价格过高，应用成本昂贵，不能满足食品和乳制品工业的需要。而基因工程技术的发展，为研制出产量高、酶学性质优良、工艺简便、成本低、更适合食品工业生产的乳糖酶提供了有效的途径。 本试验利用基因工程技术，构建真核表达载体pPIC9-cDNA，并且利用毕赤酵母表达系统成功的高效分泌表达了来源于亮白曲霉的乳糖酶，表达量达6g/L。在此基础上对高表达菌株的插入位点进行了鉴定，结果显示1<'＃>、7<'＃>初步认为整合方式相同，并且与25<'＃>整合方式不同，这为寻找高表达的菌株与插入位点之间的关系，为获得高表达菌株奠定理论基础。 同时在小试水平对乳糖酶的发酵工艺进行了研究和优化，成功的摸索出乳糖酶发酵的最佳条件为10％接种量，温度30℃，pH5.2，菌体生长时间24～28h，甲醇添加量由DO控制，诱导方式首先采取了葡萄糖一甲醇混合物进行过渡期，随后是甲醇诱导的方式，这将为乳糖酶大规模工业化生产提供借鉴。最后，根据乳糖酶发酵液中颜色较深，盐浓度高等特点和后期纯化工艺的要求，选择了膜分离技术来处理发酵液，其中主要从微滤提取、超滤浓缩两步操作过程对酶活性的影响进行了研究，就超滤而言，温度25℃，操作压力小于0.12MPa，浓缩倍数10倍时，酶活损失最少，膜最容易清洗。

目录

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论文说明：图表目录及缩略语表

声明

1引言

1.1乳糖酶

1.1.1乳糖酶来源

1.1.2 β-半乳糖苷酶的应用

1.1.3真核基因表达系统

1.2重组酵母菌的高密度发酵表达

1.2.1 pH值的控制

1.2.2温度对发酵的影响

1.2.3溶氧对发酵的影响

1.3膜工程

1.3.1膜材料

1.3.2膜分离技术的分类

1.3.3膜组件结构

1.3.4膜分离技术的应用

1.3.5膜的污染与清洗

1.4本课题研究意义

2实验一乳糖酶基因真核重组表达载体的构建

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果与分析

2.2.1载体构建图

2.2.2载体和片段的制备结果

2.2.3重组质粒pPIC9-cDNA酶切鉴定结果

2.2.4重组酵母转化子的筛选

2.3讨论

2.3.1甲醇营养型酵母表达系统的优点

2.3.2重组质粒pPIC9-cDNA线性化的原因

2.3.3巴斯德毕赤酵母的转化方法的选择

2.3.4毕赤酵母发酵培养基的选择

2.4小结

3实验二重组毕赤酵母阳性转化子的分子检测

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果分析

3.2.1重组酵母中乳糖酶基因PCR鉴定

3.2.2重组酵母转化子的Southern blotting分析

3.3讨论

3.3.1 PCR和Southern鉴定的选择

3.3.2膜的选择

3.3.3转移方法的选择

3.4小结

4实验三乳糖酶发酵工艺的摸索

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2实验方法

4.2结果分析

4.2.1发酵罐接种量对发酵的影响

4.2.2最佳补糖时间的确定

4.2.3菌体浓度的测定结果

4.2.4菌体湿重的测定结果

4.2.5乳糖酶活性的检测

4.2.6发酵上清SDS-PAGE

4.3发酵讨论

4.3.1毕赤酵母培养基碳源确定

4.3.2种子扩增

4.3.3发酵条件对产酶的影响

4.3.4甲醇的诱导方式

4.4小结

5实验四发酵液后处理

5.1材料与方法

5.1.1材料

5.1.2实验方法

5.1.2 0.2μm和20kD中空纤维组件清洗步骤

5.2结果分析

5.2.1 0.2μm中空纤维组件膜通量随过滤时间的变化

5.2.2 20kD中空纤维组件处理乳糖酶发酵过程中适宜浓缩倍数的确定

5.2.3两种膜清洗结果

5.3讨论

5.3.1中空纤维组件的选择

5.3.2 0.2μm膜的选择

5.3.3 20kD膜的选择

5.4小结

6结论

致谢

参考文献

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