梅花鹿β-防御素-1(siBD-1)全长cDNA克隆及序列分析

摘要

防御素（defensins）是一类广泛分布于动植物界的富含半胱氨酸的阳离子内源性抗微生物肽，既是生物体内先天性免疫的重要组成成分，又是黏膜表面抗微生物屏障的组成成分。据防御素的分子特征、基因结构及表达位置不同可分为α—防御素、β—防御素、θ—防御素、昆虫防御素和植物防御素五种类型，其中β—防御素主要分布于哺乳动物及禽类的黏膜上皮细胞内。梅花鹿是我国一级保护动物，其全身都可入药，具有丰富的药用价值和经济价值。舌是梅花鹿与外界的直接接触器官，舌黏膜不仅是一层物理屏障还是化学屏障。 本研究从梅花鹿舌黏膜上皮组织中提取总RNA，通过反刍动物β—防御素的cDNA保守序列设计一对引物，采用RT—PCR（Reverse Transcription PCR）技术扩增出梅花鹿β—防御素（sikaβ—defensin-1，siBD-1） cDNA的中间片段，并重组到PMD18—T载体中，进行双酶切鉴定，将酶切鉴定正确的质粒进行测序。测序结果证实所克隆的cDNA为梅花鹿β—防御素（siBD-1）。该cDNA包含一个由192个碱基组成的开放读码框（Open Reading Frame，ORF）并编码64个氨基酸的防御素前原肽，该防御素前原肽含有β—防御素的特征性结构，即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基（C）。接着又采用cDNA末端快速扩增（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE）法成功克隆出全长418bp梅花鹿β—防御素（siBD-1）cDNA全序列，其中包含192bp的ORF，89bp的5’非翻译区（5’UTR），118bp的3’UTR及poly（A）16。在siBD-1前原肽所包含的64个氨基酸中，包括由20个氨基酸残基组成的信号肽、6个氨基酸残基组成的前片段和38个氨基酸残基组成的成熟肽。在预测的38个氨基酸残基的成熟肽中有9个带正电荷的氨基酸残基（5个精氨酸R，3个赖氨酸K，1个组氨酸H），没有带负电荷的氨基酸，因此siBD-1是一个阳离子肽。 经DNAStar软件对siBD-1的核苷酸序列及氨基酸序列进行同源性分析，结果表明：siBD-1与牛的β—防御素同源性最高，与驯鹿、山羊、绵羊和骆驼的β—防御素的同源性次之，与人和猪的β—防御素的同源性最低。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

1引言

1.1梅花鹿的简介

1.1.1梅花鹿分布范围

1.1.2梅花鹿外形特征

1.1.3梅花鹿生活习性与生活环境

1.1.4梅花鹿生长繁殖

1.1.5梅花鹿经济价值

1.1.6梅花鹿生物学特性

1.1.7梅花鹿遗传物质基础研究概况

1.2防御素的简介

1.2.1防御素的发展起源

1.2.2防御素在生物界的大体分类

1.2.3 β-防御素在动植物体内的分布

1.2.4 β-防御素的分子结构特征

1.2.5 β-防御素的基因结构与表达

1.3本实验研究的目的及意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验动物组织

2.1.2实验药品及试剂

2.1.3实验常用溶液

2.1.4主要仪器设备

2.1.5引物的设计及合成

2.2实验方法

2.2.1模板RNA的提取与检测

2.2.2利用RT-PCR技术扩增siBD-1的中间片断

2.2.3采用RACE法扩增siBD-1的全序列

3实验结果

3.1梅花鹿舌黏膜上皮细胞总RNA的检测结果

3.2 SIBD-1中间片断的扩增结果

3.2.1 siBD-1中间片断的克隆及重组质粒的筛选与酶切鉴定

3.2.2 siBD-1中间片断的测序结果

3.3 RACE法的扩增结果

3.3.1 3'RACE的扩增结果

3.3.2 3'RACE产物的克隆及重组质粒的筛选与酶切鉴定

3.3.3 3'RACE的测序结果

3.3.4 5'RACE的扩增结果

3.3.5 5'RACE产物的克隆及重组质粒的筛选和鉴定

3.3.6 5'RACE的测序结果

3.3.7 siBD-1的全序列分析

3.3.8 siBD-1与其它哺乳动物β-防御素的核苷酸序列同源性分析

3.3.9 siBD-1与其它哺乳动物β-防御素的氨基酸序列同源性分析

4讨论

4.1关于siBD-1的核苷酸序列特性

4.2关于siBD-1的氨基酸序列特性

4.3关于siBD-1抗菌机制及抗菌性能分析

4.4关于siBD-1与其它哺乳动物β-防御素的同源性比较

5结论

致 谢

参考文献

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