多浪羊成纤维细胞库的构建及川陈皮素对其细胞凋亡的影响

摘要

为了进一步的探索体细胞保存在物种遗传资源保存中的应用，本试验以我国地方品种多浪羊为研究对象，采用组织块贴壁培养方法建立了多浪羊成纤维细胞系，并根据美国ATCC的建系标准对所建的细胞系进行了生物学检测，并继续研究了川陈皮素对其多浪羊成纤维细胞凋亡的影响。研究结果如下： 1.多浪羊的样本含量为40，细胞传代次数为3代，冻存管数为103支，每支冻存管中的细胞数量为3.88×106个细胞/ml。 2.所培养的多浪羊细胞具有典型的成纤维形态，绝大部分呈梭形或者不规则三角形。细胞生长时呈火焰状、旋涡状或者放射状走势，在镜想下观察，细胞生长健康且形态良好。 3.多浪羊成纤维细胞复苏后，其生长曲线均呈“S”型，细胞经历了潜伏期、对数生长期及停滞期，符合细胞在体外生长繁殖的一般规律。冻存前存活率为96.8％；复苏后存活率为94.4％。 4.对所建多浪羊细胞系进行细菌、真菌及支原体等微生物检测，结果均呈为阴性。 5.核型分析表明，多浪羊的二倍体染色体数目2n=54，未见异常，染色体畸变率均低于3％，染色体结构未有变异，表明所建多浪羊细胞系的细胞均为稳定的二倍体细胞，在体外遗传性能稳定。 6.多浪羊细胞的LDH和MDH同工酶酶谱分析表明，呈现其独特的条带，LDH同工酶为5条：MDH同工酶为2条，具有着种属特异性，可作为品种和物种分类的主要依据之一。细胞遗传性能稳定，表明未发生恶性转化及与其它物种细胞的交叉污染。 7.通过凋亡细胞形态观察，细胞周期、细胞膜电位、细胞凋亡率的检测，结果表明：50mg/L、60 mg/L、70 mg/L、80 mg/L、90 mg/L的川陈皮素作用48h后，AO/EB染色并在光镜下观察，50mg/L、60 mg/L组细胞形态无明显改变，70 mg/L、80 mg/L、90 mg/L组细胞出现明显形态的改变、胞体变小、撕裂、皱缩等。大部分细胞很快的崩解、坏死，出现典型的凋亡特征。Annexin V/PI双染法检测到随着川陈皮素浓度的增大而凋亡率明显增高。罗丹明123结合流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位，发现与对照组相比，川陈皮素处理组细胞的线粒体膜电位明显降低。以上凋亡效应均里浓度依赖性增强。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

1引言

1.1畜禽遗传资源概况

1.1.1国外畜禽遗传资源的概况

1.1.2中国畜禽遗传资源的概况

1.1.3畜禽遗传资源的保存

1.2体外动物细胞库的建立

1.2.1建立动物细胞库的必要性

1.2.2动物细胞的体外培养

1.3动物细胞在体外的培养过程

1.3.1原代培养

1.3.2传代培养

1.3.3细胞的冻存与复苏

1.4动物细胞库的质量检测

1.4.1细胞形态学及活力检测

1.4.2细胞的微生物污染检测

1.4.3细胞遗传学特征

1.5川陈皮素对动物细胞凋亡的影响

1.6研究的主要目的和意义

2试验材料和方法

2.1试验材料

2.1.1试验对象

2.1.2主要仪器设备

2.1.3主要试剂

2.1.4试剂的配制

2.2试验方法

2.2.1细胞的原代培养

2.2.2细胞的传代培养

2.2.3细胞冻存

2.2.4细胞复苏

2.2.5细胞的活率测定

2.2.6绘制细胞生长曲线

2.2.7细胞微生物污染检测

2.2.8个体、种间交叉污染的检测

2.2.9细胞凋亡检测

3试验结果与分析

3.1细胞形态特征

3.1.1原代细胞的生长

3.1.2传代细胞的生长

3.1.3细胞的冻存与复苏

3.1.4细胞生长曲线

3.2细胞培养微生物学检测

3.2.1支原体检测

3.2.2核型检测与分析

3.2.3同工酶检测

3.3川陈皮素对多浪羊成纤维细胞凋亡的影响

3.3.1流式细胞仪检测细胞凋亡

3.3.2细胞凋亡的形态学观察

4讨论

4.1构建细胞库的影响因素

4.1.1关于取材和培养过程中的污染问题

4.1.2影响细胞培养的因素

4.1.3关于细胞传代中的问题

4.1.4细胞冻存与复苏

4.2细胞库生物学检测方面的问题

4.2.1染色体的制备中的一些问题

4.2.2关于染色体稳定性的一些问题

4.2.3细胞遗传稳定性的保持方面的一些问题

4.2.4同工酶分析方面的一些问题

4.3细胞凋亡方面问题

4.3.1Annexin V/PI双染法检测方面问题

4.3.2细胞膜电位检测方面问题

4.3.3凋亡细胞形态学检测方面问题

5结论

致谢

参考文献

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