绵羊食欲素基因cDNA片段的克隆及生物信息学分析

摘要

本试验参照GenBank中已发表的哺乳动物（人、大鼠、小鼠、猪、狗等）的食欲素基因保守区序列设计合成引物，以绵羊下丘脑组织总RNA为模板，通过RT—PCR方法扩增获得246bp的cDNA片段；再根据获得的序列设计特异性引物，通过3’RACE技术获得244bp的cDNA片段，其中3’端编码区为126bp，非编码区为119bp。将两段序列拼接获得468bp的具有完整3’非编码区的cDNA序列。将该核苷酸序列与GenBank数据库中已经公布的序列进行相似性搜索，检索结果表明，与猪的同源性最高，为91.3％；与鸡的同源性最低，为55.7％；与人、鼠、狗的同源性分别为90.7％、81.7％、89.9％。应用生物信息学技术对绵羊食欲素基因cDNA序列推导的orexin A和orexin B小肽分别进行分析和预测，结果显示：绵羊的orexin A是由33个氨基酸编码的小肽，蛋白分子式为C152H249N47O45S4，分子量3583.1 u，理论等电点pI为7.90，由两个α螺旋组成，其夹角为59.1°，NH2端有两个二硫键存在；orexin B是由28个氨基酸编码的小肽，蛋白分子式为C125H213N43O35S1，分子量2910.3u，理论等电点pI为12.30，由两个α螺旋组成，其夹角为90.3°。本试验首次成功获得具有完整3'非编码区的绵羊食欲素基因的468bp cDNA片段，为进一步克隆绵羊食欲素基因全长cDNA序列以及研究该基因在组织中的分布定位、特异表达奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

1 引言

1.1食欲素(orexin)的研究进展

1.2食欲素(orexin)及其受体的结构

1.2.1食欲素前体肽(preproorexin)的结构

1.2.2 Orexin的结构

1.2.3 Orexin受体的结构

1.3 Orexin及其受体的分布

1.3.1 Orexin及其受体在脑内的分布

1.3.2 Orexin及其受体在外周器官的分布

1.4 Orexin的作用机制

1.5 Orexin的生理功能

1.5.1对摄食和饮水的调节

1.5.2对睡眠和觉醒的影响

1.5.3对内分泌的作用

1.5.4对心血管和内脏活动的影响

1.5.5与其他神经肽和激素的关系

1.5.6与神经系统疾病的关系

1.5.7其它作用

1.6绵羊食欲素基因研究展望

2材料与方法

2.1材料

2.1.1试验动物及组织

2.1.2主要仪器和设备

2.1.3药品与试剂

2.1.4 RT-PCR引物的设计和合成

2.2方法

2.2.1绵羊下丘脑总RNA提取及检测

2.2.2利用RT-PCR方法扩增绵羊orexin基因cDNA片段

2.2.3 3'RACE法获得绵羊orexin基因的3'端序列

2.2.4绵羊orexin基因的序列拼接

2.2.5绵羊orexin基因的核酸序列及氨基酸序列特性分析

2.2.6绵羊orexin基因核酸序列及氨基酸序列同源性分析

2.2.7绵羊orexin A和orexin B小肽的生物信息学分析

3 结果

3.1绵羊下丘脑总RNA检测结果

3.2绵羊orexin基因RT-PCR扩增结果

3.3 3'RACE扩增结果

3.4重组质粒PCR鉴定结果

3.5绵羊orexin cDNA克隆测序结果

3.6绵羊orexin cDNA片段核苷酸序列及推导氨基酸序列特性分析

3.7绵羊orexin cDNA序列片段同源性分析

3.8绵羊orexin推导氨基酸序列同源性分析

3.9绵羊orexin A推导氨基酸序列分析

3.10绵羊orexin B推导氨基酸序列分析

4 讨论

4.1 RT-PCR引物的设计

4.2绵羊orexin基因cDNA片段扩增及克隆

4.2对绵羊orexinA与orexinB的分析

5 结论

6今后的研究方向

致谢

参 考 文 献

作 者 简 介