绵羊β-防御素cDNA片段的克隆及在酵母中的表达

摘要

该研究根据已发表的绵羊β-防御素cDNA的基因序列(推测此段序列由前体肽和成熟肽组成)的成熟肽片段序列,设计了一对特异性引物,以克隆于T-easy-vector质粒上sBD-1cDNA全长基因为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术,对绵羊β-防御素cDNA成熟肽片段进行扩增,扩增出目的基因特异性条带,通过T4DNA连接酶将其连接于T-easy-vector上,通过电转化法将重组质粒转化到大肠杆菌受体菌DH10B中,蓝白斑筛选阳性菌落,通过菌落PCR、质粒PCR扩增及质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳检测,证明重组质粒中含有绵羊β-防御素cDNA成熟肽片段,测序结果表明所克隆的绵羊β-防御素cDNA的成熟肽片段含有的129个碱基中,与已知的绵羊β-防御素cDNA序列相比其核苷酸有一个碱基的差异,这可能与品种差异有关,我们将重组质粒取名为T-sBD-1cDNA.研究结果表明:成功地从绵羊中分离到绵羊β-防御素cDNA成熟肽片段,该序列由129个碱基组成,编码42个氨基酸,并构建了酵母表达载体,并初步在毕赤酵母中进行了表达,这为进一步了解绵羊防御素基因的结构特性和应用开发研究奠定了一定的理论基础.

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文摘

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英文缩写词表

前言

一文献综述：哺乳动物抗菌肽研究

一.抗菌肽概述

二.哺乳动物抗菌肽的类型

2.1防御素类

三.不同哺乳动物抗菌肽研究简介

3.1猪抗菌肽

3.2牛、羊抗菌肽

3.3鼠抗菌肽

四.防御素的生物合成、加工及定位

五.抗菌肽的作用机理

六.抗菌肽的生物学活性

七.阳离子抗菌肽在宿主防卫中发挥作用的证据

八.阳离子抗菌肽与传统抗生素、溶酶菌以及抗菌肽之间的协同效应

九.抗菌肽的基因表达调控和基因工程

十.研究展望

10.1医学及药用价值

10.2转基因研究及应用

10.3抗菌肽基因表达调控及抗菌肽添加剂研究

10.4在食品中的应用

参考文献

二实验部分

实验一绵羊β-防御素cDNA片段克隆及序列分析

一.材料与方法

二.结果与分析

三.讨论

实验二：绵羊β-防御素cDNA片段在酵母中的表达

一.材料与方法

二.结果与分析

三.讨论

实验研究结论

创新点

参考文献

附图：实验技术路线

附图：pPIC9K载体图

附录

附录1主要溶液配制

附录2主要培养基配制

附录3主要实验方法

附录4 SDS-PAGE凝胶电泳检测

附录5酵母的Licl转化

附图：克隆结果测序图

附图：扩增片段插入表达载体方向鉴定的测序图

攻读学位期间的研究成果

致谢

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