酸马奶中屎肠球菌MKB64细菌素特性及其相关基因的研究

摘要

随着生活水平的提高和食品安全意识的增强，人们对食品的安全卫生日益关注，因此研究开发广谱、高效、安全、稳定的天然抗菌物质已成为当今国际食品防腐剂发展的主要方向。细菌素是乳酸菌通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活性的多肽或前体多肽。乳酸菌中的屎肠球菌(Enterococcus faecium)可以产生细菌素，且这些细菌素分子质量小、热稳定性强，尤其对食源性病原菌单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)有强烈的抑制作用，因而具有作为食品防腐剂的潜力。本研究以内蒙古牧区传统乳制品中的酸马奶为研究对象，从其中分离乳酸菌，并对产抑菌物质的乳酸菌进行了筛选、鉴定，最后对具有抗单核细胞增生李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌的E. feasium MKB64所产的细菌素进行了发酵条件优化、理化特性、细菌素相关基因的克隆表达研究。通过以上研究，为开发新型微生物源天然防腐剂提供理论基础，并获得以下主要研究结果：
　　（1）从15份酸马奶样品中共分离到140株乳酸菌。采用琼脂扩散法从中筛选出31株对指示菌具有明显抑菌作用的乳酸菌。通过排酸及排过氧化氢试验，9株乳酸菌仍表现一定的抑菌活性。通过传统生理生化试验和16SrDNA序列系统发育分析对这9株菌进行了鉴定，菌株 MKB6、MKB38、MKB41、MKB49、MKB57均鉴定为瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus），菌株 MKB63和MKB64鉴定为屎肠球菌(Enterococcus faecium），菌株MKB84鉴定为食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria），菌株MKB87鉴定为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）。其中Enterococcus faecium MKB64（E. faecium MKB64）的无细胞发酵上清液对单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes CMCC54002)和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC25923）均显示了较强的抗菌活性，因此将菌株E. faecium MKB64确定为进一步研究抗菌物质的供试菌株。
　　（2）通过单因素试验和正交试验，优化了E. faecium MKB64产细菌素的条件。确定了E. faecium MKB64产细菌素的最佳发酵条件是在初始pH为7.0MRS培养基中以1％的接种量，接种种龄为16h的种子发酵液，34℃静止培养24h，即可达到最大的抑菌活性。优化了培养基的氮源与碳源成分，确定了最佳的培养基组分为：胰蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨20g/L，酵母粉15g/L，蔗糖30g/L，柠檬酸三钠2g/L，磷酸氢二钾2g/L，乙酸钠5g/L，Tween802g/L、硫酸镁200mg/L，硫酸锰50mg/L。在此条件下培养E. faecium MKB64产生的细菌素抑菌活力比优化前提高了51.3%。
　　（3）研究了E. faecium MKB64产细菌素的理化特性。E. faecium MKB64产生的细菌素具有热稳定性，在121℃加热30min依然保持抑菌活性，在4℃保藏时的抑菌活性高于-20℃保藏效果，在pH2.0~8.0范围内显示抗菌活性。E. faecium MKB64产生的细菌素可以被胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶 K失活，但不能被溶菌酶、过氧化氢酶失活。因此表明该细菌素为蛋白类物质或者非单一的抗菌物质。该细菌素作用方式是抑菌，而不是杀菌，抗菌物质仅对革兰氏阳性菌显示了抗菌活性，是一种窄谱抗菌活性的细菌素。
　　（4）从E. faecium MKB64中提取质粒DNA作为模板，根据Genebank公布的肠球菌素结构基因及其相关基因，设计13对特异性引物进行PCR扩增，得到了entB、entF、entD、entK和entR目的条带，将该片段克隆到pGM-T载体，测序，与发表的基因序列比较，同源性可达99%以上。
　　（5）通过原核表达系统，构建 pentB、entB基因的原核表达载体，获得高表达的蛋白，经纯化、鉴定，得到Enterocin B，发现其对L. monocytogenes CMCC54002的生长有抑制作用。并说明了Enterocin B发挥抑菌作用的主要是其成熟肽，而并非含前导肽的前体肽。

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附表清单

1 前言

1.1 酸马奶的研究进展

1.2 细菌素研究进展

1.3 肠球菌素研究进展

1.4 本研究的立题意义及主要研究内容

2 产抑菌物质乳酸菌的筛选及其菌株鉴定

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

2.5 小结

3 E. faecium MKB64产细菌素发酵条件的优化

3.1 试验材料

3.2 试验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 小结

4 E. faecium MKB64产细菌素的理化特性研究

4.1 试验材料

4.2 试验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5 小结

5 E. faecium MKB64肠球菌素基因的检测

5.1 试验材料

5.2 试验方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论

6 Enterocin B表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

6.1 试验材料

6.2 试验方法

6.3 结果与分析

6.4 讨论

7 总结论

致谢

参考文献

作 者 简 介