蓝刺头水提物对实验性Ⅰ型糖尿病小鼠降血糖作用及其机理研究

摘要

糖尿病是继肿瘤和心血管疾病之后第三大影响人类健康的疾病，其发病人数呈逐年上升的趋势。因此，寻找使用方便、疗效确切的血糖控制药物，对糖尿病及其并发症的治疗显得十分重要。蓝刺头具有多种药理活性，民间有利用蓝刺头进行糖尿病辅助治疗的传统，但国内外均未见相关研究报道，本文以Ⅰ型糖尿病小鼠模型为研究对象对蓝刺头水提物(WET)的降血糖作用进行观察，进而确定了蓝刺头水提物中降血糖的有效成分，并对其降血糖的分子机理进行了相关研究，以便为新型降血糖药物的开发提供参考依据。
　　1.在按照85mg/kg体重剂量尾静脉注射1％的四氧嘧啶溶液成功构建Ⅰ型糖尿病小鼠模型的基础上，对WET的降血糖作用进行了观察。结果发现，WET能够显著地降低糖尿病小鼠的空腹血糖，改善口服糖耐量，升高肝糖原和血清胰岛素含量，对糖尿病小鼠的体重和胰高血糖素影响不显著;而对健康小鼠的空腹血糖、口服糖耐量、肝糖原、血清胰岛素、体重和胰高血糖素含量均不产生影响。确定WET对Ⅰ型糖尿病小鼠具有降血糖作用，对健康小鼠血糖不产生影响。
　　2.为确定WET中降血糖的有效成分，首先对WET中可能含有的降血糖物质进行了鉴定，结果显示WET中确定含有多糖类成分，并采用水提醇沉法获得蓝刺头粗多糖(ETCP)。对比ETCP及其剩余成分(ETX)的降血糖效果后发现ETCP能够显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖。采用木瓜蛋白酶法去除ETCP中的蛋白质，并对其工艺参数进行优化，在反应时间为2.6h，体系pH为6.0，反应温度为64℃的条件下多糖保留率为98.12％，蛋白清除率为56.57％。将脱蛋白后的蓝刺头多糖(ETP)使用DEAE-52柱层析进行分离纯化，采用不同浓度NaCl溶液进行洗脱分级得到一种中性多糖ETPA和两种酸性多糖ETPB、ETPC。将三种多糖分别经Sephadex G200柱层析，采用蒸馏水进行洗脱分级，确定ETPA含有两种不同分子量的多糖ETPA1、ETPA2，ETPB和ETPC各为分子量均一的多糖。对ETPA、ETPB、ETPC的降血糖效果进行比较后发现ETPB能够显著的降低Ⅰ型糖尿病小鼠的空腹血糖，确定WET中降血糖的主要成分为ETPB。
　　3.对灌胃ETPB后Ⅰ型糖尿病小鼠的空腹血糖、体重、口服糖耐量、肝糖原、血清胰岛素和胰高血糖素含量进行了测定，并利用实时荧光定量PCR的方法对小鼠胰腺中PDX-1、IRS-2、Fas、caspase-3、GK、GLUT2及肝脏中GK、G-6-P基因的相对表达量进行了研究，分析ETPB对Ⅰ型糖尿病小鼠降血糖作用的分子机制。结果发现ETPB能够降低糖尿病小鼠的空腹血糖，增加体重，改善口服糖耐量，增加肝糖原和血清胰岛素含量，对胰高血糖素无影响。实时荧光定量PCR对各基因的测定结果显示，ETPB能够上调胰腺中PDX-1、IRS-2、Fas、 caspase-3、GK、GLUT2基因及肝脏中GK基因的表达，对肝脏中G-6-P基因表达无影响。综合分析ETPB降血糖的分子机理为ETPB通过上调胰腺PDX-1和IRS-2基因的表达，增加胰岛β细胞的再生，下调胰腺中凋亡相关因子Fas，caspase-3基因的表达抑制胰岛β细胞的凋亡，促进胰岛β细胞中GK、GLUT2基因的表达增加血清胰岛素的含量，同时促进肝脏中GK基因的表达提高肝脏糖代谢能力，相关实验研究也证明了这一结论。
　　全文研究表明，WET具有较好的降血糖作用，其中ETPB为其降血糖作用的主要成分，其可能机制包括促进胰岛β细胞的再生、抑制胰岛β细胞的凋亡、促进胰岛素的分泌、提高肝脏糖代谢能力。但ETPB的结构有待进一步的明确，同时其降血糖作用机理需进行更深入的研究，为蓝刺头作为降血糖药物的开发提供更充足的数据。

目录

声明

摘要

缩略语表

引言

1 Ⅰ型糖尿病的研究进展

1．1 Ⅰ型糖尿病的发病机制

1．2 Ⅰ型糖尿病的胰岛变化

1．3 Ⅰ型糖尿病的药物治疗

1．4 降血糖中药的有效成分及作用机制

2 蓝刺头属植物的研究进展

2．1 化学成分研究

2．2 药理作用

3 本论文研究的目的和意义

参考文献

实验一 蓝刺头水提物对实验性Ⅰ型糖尿病小鼠降血糖作用的研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果及分析

2．1 WET对小鼠血糖的影响

2．2 WET对小鼠体重的影响

2．3 WET对小鼠口服糖耐量的影响

2．4 WET对小鼠肝糖原的影响

2．5 WET对小鼠胰岛素、胰高血糖素的影响

3 讨论

3．1 Ⅰ型糖尿病模型的构建

3．2 WET对小鼠血糖的影响

3．3 WET对小鼠体重的影响

3．4 WET对小鼠口服糖耐量的影响

3．5 WET对小鼠肝糖原的影响

3．6 WET对小鼠胰岛素的和胰高血糖素的影响

4 小结

参考文献

实验二 蓝刺头水提物降血糖有效成分的研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果及分析

2．1 WET降血糖有效成分预实验

2．2 WET降血糖有效成分初步判断

2．3 最大波长的选择

2．4 葡萄糖标准曲线的绘制

2．5 牛血清白蛋白标准曲线的绘制

2．6 三种除蛋白方法效果比较

2．7 pH对蛋白清除率的影响

2．8 时间对蛋白清除率的影响

2．9 温度对蛋白清除率的影响

2．10 响应面分析结果

2．11 最佳工艺验证

2．12 DEAE-52洗脱曲线

2．13 Sephadex G-200洗脱曲线

2．14 ETP降血糖有效成分的确定

2．15 紫外光谱分析

3 讨论

3．1 WET降血糖主要成分的判断

3．2 蓝刺头多糖中蛋白质的清除

3．3 蓝刺头多糖的分离纯化

4 小结

参考文献

实验三 ETPB的降血糖机理研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果及分析

2．1 ETPB对小鼠血糖的影响

2．2 ETPB对小鼠体重的影响

2．3 ETPB对小鼠口服糖耐量的影响

2．4 ETPB对小鼠肝糖原的影响

2．5 ETPB对小鼠胰岛素和胰高血糖素的影响

2．6 RNA纯度鉴定

2．7 引物合成

2．8 各基因的相对定量分析结果

3 讨论

3．1 ETPB对小鼠一般状态的影响

3．2 ETPB对胰岛细胞再生的影响

3．3 ETPB对胰岛细胞凋亡的影响

3．4 ETPB对胰岛素分泌的影响

3．5 ETPB对肝糖代谢的影响

4 小结

参考文献

结论

论文创新点

致谢

作者简介