C型钠肽对牛卵母细胞体外成熟的影响以及牛早期胚胎凋亡、印记基因表达的研究

摘要

卵母细胞的体外成熟(in vitro Maturation，IVM)技术和胚胎体外培养(in vitroCulture，IVC)是生殖生物学中的关键技术，在畜牧业生产中有广泛的应用。为了提高牛卵母细胞体外成熟质量以及提高早期胚胎发育的质量，本论文研究了减数分裂抑制剂C型钠肽（C-type natriuretic peptide，CNP）预处理牛卵母细胞后对卵母细胞的成熟质量的影响，同时研究了不同氧气浓度对胚胎细胞凋亡的影响以及父源与母源性印记基因在牛早期胚胎体外发育过程中的差异性表达。
　　本研究得到以下几点结论:
　　1、以常规的牛卵母细胞体外成熟24 h为对照，研究了CNP预处理牛卵母细胞6h，再进行成熟培养28 h后的成熟情况。发现经CNP预处理组获得的成熟卵母细胞，从线粒体分布、线粒体DNA拷贝数水平以及受精后胚胎发育成囊胚的质量均优于常规成熟的卵母细胞，表明C型钠钛预处理可以有效改善牛卵母细胞体外成熟的质量。
　　2、分别检测了常规方法成熟卵母细胞和CNP预处理组的成熟卵母细胞的ROS水平和GSH浓度，结果显示利用C-型钠肽对牛卵母细胞预处理6h然后体外成熟28 h会导致牛卵母细胞内ROS水平的提高，但是，由于GSH在此过程中对活性氧的清除作用保护了卵母细胞的受精能力及受精后胚胎的发育能力。表明利用CNP预处理进行的牛卵母细胞两步成熟过程没有引起卵母细胞老化。
　　3、研究了不同氧气浓度对牛早期胚胎细胞的凋亡以及凋亡基因表达水平的影响，结果表明在低氧环境中培养的胚胎的凋亡水平明显低于高氧环境中的胚胎，表明低氧环境更有利于牛体外受精胚胎的发育;并且培养环境中的氧气浓度在一定程度上影响了牛胚胎细胞中凋亡相关基因Mcl-1、Bad、Bak、Bik和Caspase-3的表达，这些基因表达产物可能相互协同影响了胚胎细胞凋亡的发生。
　　4、利用Real-time PCR技术分别检测三个父源性印记基因Gnas、Grb10、Xist和三个母源性印记基因Magel2、Sgce和SNRPN在牛孤雌激活(ParthenogeneticActivation，PA)胚胎和体外受精(In Vitro Fertilization，IVF)胚胎中的表达水平。结果显示在IVF和PA胚胎发育过程中，父源性印记基因和母源性印迹基因表达模式存在一定的差异，这对牛早期胚胎的正常发育可能发挥重要作用。
　　总之，以C型钠钛预处理为基础的两步成熟法可以有效改善牛卵母细胞的体外成熟质量;低氧环境降低了牛胚胎体外发育过程凋亡的发生，更有利于牛体外受精胚胎的发育;牛早期胚胎的正常发育是培养环境、凋亡基因和印记基因等基因相互协同的结果。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略语表

1 引言

1．1 卵母细胞成熟

1．1．1 卵子发生

1．1．2 牛卵母细胞的体外成熟

1．1．3 卵母细胞体外成熟的研究进展

1．2 CNP对家畜繁殖的作用机制

1．2．1 C-型钠肽

1．2．2 CNP与动物生殖

1．2．3 CNP作用机制

1．3 卵母细胞中和胚胎中的线粒体

1．3．1 卵母细胞和胚胎中线粒体的产生及分布

1．3．2 线粒体在卵母细胞中分布模式的研究

1．3．3 卵细胞和胚胎中线粒体与ATP的关系

1．3．4 卵母细胞和胚胎中线粒体与氧化还原代谢的关系

1．3．5 线粒体活性对卵母细胞发育成熟和胚胎发育的重要性

1．4 哺乳动物卵母细胞中的mtDNA

1．4．1 卵母细胞中线粒体DNA拷贝数的研究

1．4．2 线粒体DNA拷贝数与ATP

1．5 哺乳动物基因组印记的研究进展

1．5．1 基因组印记的发现

1．5．2 基因组印记的特点

1．5．3 基因组印记的印记机制

1．5．4 印记基因的表达调控

1．5．5 基因组印记与胚胎发育的关系

1．6 早期胚胎细胞凋亡

1．6．1 胚胎生产与细胞凋亡

1．6．2 胚胎细胞的凋亡与胚胎发育

1．6．3 凋亡的途径

1．6．4 胚胎细胞凋亡的影响因素

1．7 影响胚胎发育的因素

1．8 本研究的目的、意义及主要研究内容

1．8．1 研究目的和意义

1．8．2 研究的主要研究内容及技术路线

2 C型钠肽处理对牛体外成熟卵母细胞线粒体分布的影响

2．1 材料

2．1．1 实验材料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 主要溶液配制

2．2 实验方法

2．2．1 卵母细胞的采集

2．2．2 CNP对牛卵母细胞处理及体外成熟培养

2．2．3 牛卵母细胞的体外受精及体外培养

2．2．4 牛卵母细胞线粒体染色

2．2．5 卵母细胞核染色及囊胚计数

2．3 结果与分析

2．3．1 体外受精胚胎质量及囊胚计数

2．3．2 线粒体分布

2．4 讨论

2．5 结论

3 C型钠肽处理对牛体外成熟卵母细胞mtDNA的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．1．4 主要溶液配制

3．2 实验步骤

3．2．1 卵母细胞的采集

3．2．2 C型钠肽预处理及卵母细胞的体外成熟

3．2．3 牛卵母细胞的体外受精及体外培养

3．2．4 线粒体DNA拷贝数检测

3．2．5 标准品的制备

3．3 结果与分析

3．3．1 体外受精胚胎质量及囊胚计数

3．3．2 卵母细胞的拷贝数检测

3．4 讨论

3．5 结论

4 C型钠肽处理对牛体外成熟卵母细胞ROS-GSH水平的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料

4．2 实验方法

4．2．1 卵母细胞的采集

4．2．2 C型钠肽预处理及卵母细胞的体外成熟

4．2．3 牛卵母细胞的体外受精及体外培养

4．2．4 卵母细胞核染色及囊胚计数

4．2．5 牛卵母细胞ROS-GSH水平检测

4．3 结果与分析

4．3．1 体外受精胚胎质量及囊胚计数

4．3．2 C型钠肽处理对牛体外成熟卵母细胞ROS水平的影响

4．3．3 C型钠肽处理对牛体外成熟卵母细胞GSH含量的影响

4．4 讨论

4．5 结论

5 不同氧气浓度对牛体外受精胚胎细胞凋亡的影响

5．1 材料

5．1．1 主要试剂

5．1．2 主要仪器

5．1．3 主要溶液配制

5．2 实验方法

5．2．1 卵母细胞的采集

5．2．2 卵母细胞体外成熟

5．2．3 体外受精

5．2．4 凋亡检测

5．2．5 凋亡基因表达量的检测

5．3 结果与分析

5．3．1 不同浓度O2对牛卵母细胞成熟的影响

5．3．2 Mcl-1在牛体外受精胚胎中的表达

5．3．3 Bad在牛体外受精胚胎中的表达

5．3．4 Bak在牛体外受精胚胎中的表达

5．3．5 Bik在牛体外受精胚胎中的表达

5．3．6 Caspase-3在牛体外受精胚胎中的表达

5．4 讨论

5．5 结论

6 印记基因在牛早期胚胎中的表达

6．1 实验材料及试剂

6．2 实验方法

6．2．1 卵母细胞的采集

6．2．2 卵母细胞的孤雌激活与重构胚的培养

6．2．3 体外受精及受精胚胎的收集

6．2．4 印记基因表达量的检测

6．3 结果与分析

6．3．1 总RNA提取与克隆测序

6．3．2 标准曲线结果

6．3．3 各基因荧光定量PCR结果

6．4 讨论

6．5 结论

7 全文总体结论及创新点

7．1 结论

7．2 创新点

致谢

参考文献

作者简介