蒙古牛和水牛BTG2启动子的克隆及功能分析

摘要

BTG2是新型细胞抗增殖因子BTG/TOB基因家族成员之一，它是由神经生长因子诱导表达产生的一种分泌蛋白，属于瞬时早期反应基因。BTG2在猪和牛中均存在品种和个体表达差异。本研究选择蒙古牛和水牛BTG2启动子区进行研究，以阐明蒙古牛和水牛BTG2差异表达分子机理。
　　本文以蒙古牛和水牛基因组DNA为模板，分别克隆获得蒙古牛和水牛1708bp、1478bp的BTG2启动子序列。序列比对结果显示，相对于蒙古牛，水牛BTG2启动子存在269bp的缺失，生物信息学分析发现，该序列存在多个转录因子结合位点，这为后续多态性分析和功能鉴定奠定了基础。将蒙古牛和水牛BTG2启动子序列分别重组到哺乳动物表达载体pEGFP-N1中，获得瞬时表达载体pBTG2(p)-EGFP，并将它们分别导入HeLa细胞，神经生长因子诱导后，均检测到报道基因GFP表达，且蒙古牛BTG2启动子转录活性高于水牛，由此推测，水牛BTG2启动子区缺失的269bp片段很可能是导致该现象的根本原因。利用qRT-PCR检测BTG2在水牛、蒙古牛肌肉组织中的实时表达状况，由此揭示BTG2启动子区269bp缺失是否影响其转录。研究结果表明，与蒙古牛相比，水牛BTG2表达明显降低，这表明缺失的269bp DNA序列很可能与BTG2启动子活性直接相关。将蒙古牛BTG2启动子区较水牛多出的269bp片段与蒙古牛核蛋白相互作用。EMSA结果表明，在DNA含量相同的条件下，随着核蛋白浓度的增加，DNA与核蛋白的结合率呈上升趋势。该研究推测，这段DNA片段中可能存在与肉品质或抗寒相关的特定的顺式元件。该研究初步预测BTG2很可能是牛肉品质以及抗寒、抗旱能力的候选基因，这为BTG2的后续研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 引言

1．1 蒙古牛、水牛概述

1．1．1 蒙古牛特征及分布

1．1．2 水牛特征及分布

1．2 BTG／TOB家族研究进展

1．3 BTG2研究进展

1．4 启动子研究进展

1．4．1 启动子概述

1．4．2 启动子的研究意义

1．4．3 启动子调控功能研究进展

1．5 电转染技术

1．6 荧光定量PCR技术

1．6．1 荧光定量PCR原理

1．6．2 SYBR Green Ⅰ染料监测PCR

1．7 凝胶电泳迁移率实验

1．8 研究的目的及意义

2 实验一 蒙古牛和水牛BTG2启动子的克隆及序列分析

2．1 材料

2．1．1 生物材料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 溶液配制

2．1．4 主要仪器及耗材

2．2 方法

2．2．1 血液DNA的提取

2．2．2 DNA浓度和纯度的检测

2．2．3 BTG2启动子的扩增

2．2．4 BTG2启动子克隆与测序

2．2．5 pBTG2(p)-EGFP瞬时表达载体的构建

2．3 结果

2．3．1 蒙古牛和水牛血液基因组提取结果

2．3．2 BTG2启动子扩增结果

2．3．3 菌落PCR产物鉴定结果

2．3．4 重组pMD-BTG2(p)限制性酶切鉴定

2．3．5 蒙古牛和水牛BTG2启动子序列分析

2．3．6 pBTG2(p)-EGFP瞬时表达载体构建结果

2．4 讨论

3 实验二 蒙古牛和水牛BTG2启动子功能的初步验证

3．1 材料

3．1．1 生物材料

3．1．2 主要试剂

3．1．3 溶液配制

3．1．4 主要仪器及耗材

3．2 方法

3．2．1 瞬时表达载体P(BTG2)-EGFP-SV40 PolyA的转染及诱导表达

3．2．2 荧光定量PCR检测BTG2的表达差异

3．2．3 蒙古牛BTG2启动子269bp EMSA检测

3．3 结果

3．3．1 HeLa细胞电转染结果

3．3．2 荧光定量PCR结果

3．3．3 EMSA分析结果

3．4 讨论

4 结论

致谢

参考文献

附录

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