内蒙古白绒山羊LEF1基因皮肤特异性表达载体及其稳定转染细胞系的构建

摘要

淋巴增强因子-1(Lymphoid enhancer factor1,LEF1)是淋巴增强因子／T-细胞因子(LEF／TCF)家族的成员之一,也是Wnt经典通路中的一个核心成分。LEF1通过与β-连环蛋白结合形成β-连环蛋白／LEF复合物,活化目标基因转录,调控细胞分化和组织自我更新,LEF1与毛囊发育及自我更新也密切相关。克隆内蒙古白绒山羊淋巴样增强因子-1(Lymphoid enhancer factor,LEF1)基因,构建皮肤特异性表达载体 pCDsRed-KL、pCDsRed-UL；转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞和皮肤成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。RT-PCR克隆LEF1基因cDNA序列,将LEF1基因到KAP6-1启动子下游,接续连接红色荧光蛋白表达元件,构建LEF1基因毛囊特异表达载体 pCDsRed2-KL。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,通过 G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在胎儿成纤维细胞基因组中的整合；PCR克隆小鼠 UHS启动子,与LEF1以及红色荧光蛋白表达元件连接构成皮肤特异性表达载体 pCDsRed-UL。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合；组织块直接培养法得到内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞初代培养物,用酶消化法纯化皮肤成纤维细胞。lipofectamineTM2000介导pCDsRed-KL、pCDsRed-UL转染皮肤成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,RT-PCR检测 pCDsRed-KL、pCDsRed-UL在皮肤成纤维细胞中的转录。
　　 本实验表明：⑴内蒙古白绒山羊LEF1基因cDNA全长1159bp,包含了1116bp的完整ORF(HM059927)。测序显示构建的表达载体中,LEF1基因正确连接在皮肤特异性 KAP6-1启动子,顺序连接 CMV启动子和红色荧光蛋白基因,pCDsRed-KL载体构建正确。PCR检测显示外源 KAP6-1启动子和 LEF1基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。⑵克隆的小鼠UHS启动子全长670bp bp。测序显示构建的表达载体中,LEF1基因正确连接在小鼠UHS启动子下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,pCDsRed-UL载体构建正确。经G418筛选得到高效表达红色荧光蛋白转基因细胞克隆。PCR检测显示外源 KAP6-1启动子和 LEF1基因整合到细胞基因组中。⑶分离纯化得到内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞。pCDsRed-KL、pCDsRed-UL转染皮肤成纤维细胞,经 G418筛选得到高效表达红色荧光蛋白转基因细胞克隆。RT-PCR检测显示 pCDsRed-KL、pCDsRed-UL在皮肤成纤维细胞中转录 LEF1。克隆到内蒙古白绒山羊 LEF1基因 cDNA,成功构建皮肤特异性表达 LEF1和稳定表达红色荧光蛋白的真核表达载体 pCDsRed—KL、pCDsRed-UL两种真核表达载体；脂质体介导的转染具有较高的效率,外源基因稳定整合到胎儿成纤维细胞基因组中,获得具有两种皮肤特异性表达目的基因 LEF-1的转基因细胞系,且在皮肤成纤维细胞中能够转录出 LEF1 mRNA。本研究为下一步通过转基因克隆技术获得高产绒量绒山羊新品系提供了条件。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略词表

第一章 绪论

1 研究背景

2 研究意义

第二章 内蒙古白绒山羊LEF1基因及小鼠UHS启动子的克隆

1 引言

2 实验材料

2.1 相关试剂

2.2 主要仪器设备

3 实验方法

3.1 内蒙古绒山羊LEF1基因的克隆

3.2 小鼠超高硫角蛋白的克隆

4 实验结果

4.1 PCR扩增内蒙古绒山羊LEF1基因

4.2 pMD-19TL重组质粒酶切鉴定

4.3 小鼠超高硫角蛋白启动子的克隆

5 讨论

第三章 LEF1基因皮肤特异表达载体构建并稳定转染胎儿成纤维细胞

1 引言

2 实验材料

2.1 相关质粒、菌种和细胞

2.2 相关试剂

2.3 主要仪器设备

3 实验方法

3.1 构建皮肤特异表达载体pCDsRed-KL并转染胎儿成纤维细胞

3.2 构建皮肤特异表达载体pCDsRed-UL并转染胎儿成纤维细胞

4 实验结果

4.1 皮肤特异表达载体pCDsRed-KL构建并转染胎儿成纤维细胞

4.2 皮肤特异表达载体pCDsRed-UL构建并转染胎儿成纤维细胞

5.讨论

第四章 LEF1皮肤特异性表达载体在内蒙古绒山羊皮肤成纤维细胞中的表达检测

1 引言

2 实验材料

2.1 相关试剂

2.2 主要仪器设备

3 实验方法

3.1 采取组织块

3.2 原代培养

3.3 表达载体pCDsRed-KL、pCDsRed-UL转染内蒙古绒山羊皮肤成纤维细胞

3.4 转基因绒山羊皮肤维细胞克隆RT-PCR鉴定

4 实验结果

4.1 分离与纯化后的内蒙古绒山羊皮肤成纤维细胞

4.2 稳定转染pCDsRed-KL、pCDsRed-UL绒山羊皮肤成纤维细胞克隆筛选

4.3 转基因pCDsRed-KL绒山羊胎儿皮肤维细胞克隆RT-PCR鉴定

4.4 转基因pCDsRed-UL绒山羊胎儿皮肤维细胞克隆RT-PCR鉴定

5 讨论

结论

参考文献

致谢

文献综述

参考文献

攻读硕士期间发表的论文和参加的研究项目