DNA甲基化调控鲂及转录起始位点

摘要

印记是一种表观遗传学现象，即亲本等位基因的选择性表达取决于亲本的来源，与正反交无关。植物中，多数印记表达是在发育种子的胚乳中观察到的。首个在分子生物学水平确定的印记基因为拟南芥MEDEA(MEA)基因，为母本特异性表达基因，对种子发育具有重要作用。目前，拟南芥和玉米中各有11个已报道的印记基因，水稻胚乳中已报道的有200多个印记基因。但印记基因依赖于亲本来源的特异性表达调控机制尚不清楚。
　　本文通过亚硫酸盐测序和染色质免疫沉淀等研究方法，分析了DNA甲基化和组蛋白H3K27me3甲基化对水稻三个印记位点(Os12g08780、Os11g36470、Os01g69110)的修饰和调控。Os12g08780为植物生长素合成基因OsYUCCA11。胚和叶片中，OsYUCCA11双亲本均受DNA甲基化修饰且正常表达。胚乳中，仅父本等位基因进行表达，其受DNA甲基化修饰，且CG甲基化高达80-95％;而母本等位基因发生沉默并伴随低甲基化和H3K27me3甲基化的富集。这种亲本等位基因的差异性表达调控方式与拟南芥中已报道的PHERES1和YUCCA10基因的调控方式相类似，证明这类生物素合成基因在印记调控机制上是保守的。
　　Os01g69110为Yellow2-like基因，编码一个类似果蝇转录因子ENHANCER OF YELLOW2蛋白。胚乳表达检测显示，亲本除正常转录外，能够产生一个较长的特异性母本转录物，起始位点位于父本转录位点上游700bp左右。母本等位基因的上游侧翼区存在DNA低甲基化，激活母本特异性转录启动子，产生增加25个氨基酸的长母本转录物。父本等位基因的相应区域则存在高度DNA甲基化，抑制长转录物的转录起始。其他组织中，DNA甲基化抑制上游转录起始，无非特异性转录物产生。以上结果证明，长转录物经剪切后产生一个在原有cDNAATG上游加一个ATG插框的mRNA。
　　Os11g36470编码一个泛素水解酶类似基因。胚乳中检测到存在被截切的母本转录物，在其他组织中也有低水平表达。父本等位基因表现基因体DNA甲基化，并产生全长的转录物。而母本的等位基因在基因体的5'端存在DNA低甲基化，同时转录起始与启动子下游。来自子母本等位基因的被截切的母本转录物，可能被翻译成短的多肽，但是缺乏主要的催化结构域，表明这一基因产物可能没有功能，因此，在胚乳中，将以父本特异性表达形式行使功能。
　　经DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷或zebularine处理水稻种子后，发现处理后幼苗的yellow2-like产生长的转录物，同时来自泛素水解酶的短转录物表达量升高。结果表明DNA甲基化能够抑制植物中异常启动子的转录起始;母本基因组低甲基化与异常转录物的产生相关，可能使来自亲本等位基因的产物更加多样化，而不是仅限于基因组cDNA注释的单一产物;在启动子和（或）基因体上，DNA差异性甲基化和组蛋白甲基化能够影响亲本等位基因的特异性表达或转录的起始位点。

目录

声明

ABSTRACT

摘要

TABLE OF CONTENTS

Chapter 1 Introduction

1．1 Endosperm development and imprinting

1．1．1 Endosperm development

1．1．2 Genomic imprinting and seed development

1．2 Epigenetic mechanisms of imprinting

1．2．1 DNA methylation

1．2．2 Histone Modification

1．3 Aims

Chapter 2 Materials and Methods

2．1 RNA and DNA isolation from rice endosperm

2．2 RT-PCR and sequencing

2．3 Bisulfite sequencing

2．4 5’RACE at Loc_Os11g36470 and Loc_os01g69110

2．5 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay using antibody against H3K27me3

2．6 Germinating Nip seeds on 5-azacytidine and zebularine solutions

Chapter 3 Results

3．1 Maternal hypomethylation and H3K27me3 together with paternal allele methylation are associated with paternal expression of Os YUCCA11

3．2 Differential DNA methylation in the promoter region of maternal and paternal alleles of Loc_Os01g69110 results in alternative transcript initiation

3．3 DNA hypomethylation in the gene body of Os11g36470 contributes to production of shorter maternally biased transcripts in the endosperm

Chapter 4 Discussion

4．1 The conserved imprinted YUCCA genes in rice and Arabidopsis are regulated by similar mechanisms

4．2 Parent of origin specific activation of cryptic promoters requires DNA demethylation

REFERENCES

Supplementary Figures

Supplementary Tables

Publication

Acknowledgement