选择性转录起始位点和反义RNA调控人DHRS4基因簇的转录

摘要

人DHRS4基因簇由DHRS4、DHRS4L2和DHRS4L1三个基因组成,它们串联排列于基因组Chr14q11.2上。DHRS4基因编码的NADP(H)依赖性视黄醇脱氢/还原酶在细胞内定位于过氧化物酶体并具有较强的视黄醇氧化和视黄醛还原活性,是参与体内维甲酸合成代谢的催化酶,与细胞内的信号传导和细胞的增殖分化等重要生理活动相关。课题组在前期的研究中克隆了DHRS4和DHRS4L2 mRNA不同形式的选择性剪接亚型,发现exon a1是DHRS4L2转录本中的一个新外显子,并且是除exon1之外的一个选择性转录起始位点。DHRS4L1是在2008年12月GenBank数据库的更新中,从DHRS4L2下游的基因位点LOC728635更名而来,目前还没有该基因表达和功能相关的文献报道。DHRS4作为细胞内参与代谢的脱氢/还原酶的编码基因,与DHRS4L2和DHRS4L1构成人类DHRS4基因簇,但它们在DNA结构和表达上各自有什么样的特点?相互之间又有怎样的相似性?它们的转录可能受到哪些因素的调节和影响?这些问题目前均还不清楚。
　　为研究人DHRS4基因簇的转录调控特点和功能,我们在本研究中:(1)首先通过RT-PCR和 cDNA末端快速扩增克隆了新命名的 DHRS4L1基因的转录本,发现DHRS4L1 RNA存在不同形式的剪接亚型,并具有exon a2和exon1两个选择性的转录起始位点。exon a2位于DHRS4L1基因上游约29 kb位置的基因间区,与DHRS4L2上游的exon a1序列同源。(2)通过免疫沉淀和蛋白质谱分析鉴定了DHRS4基因剪接亚型蛋白NRDR A2,免疫荧光分析显示NRDR A2定位于细胞核,提示剪接亚型蛋白在细胞内定位发生改变。(3)结合本课题组的研究成果以及GenBank数据库中有关DHRS4基因簇的信息,序列比对发现在人DHRS4L2和DHRS4L1转录本中,所有exon a(包括exon a1和exon a2)起始转录的选择性剪接亚型均缺失exon1。序列分析显示exon1缺乏典型的剪接受体位点AG,因此可能导致DHRS4L2和DHRS4L1 exon1在exon a起始的转录本中缺失。(4)DHRS4基因5’端负链位置上存在反义转录基因C14orf167,与DHRS4呈头对头的反向重叠。由于DHRS4、DHRS4L2和DHRS4L1之间的同源性,我们预测反义转录本可能在转录和转录后水平调控整个DHRS4基因簇的转录活性。(5)在人肝癌细胞HepG2和肝细胞系HL-7702中,通过RNAi干扰反义RNA后,定量PCR检测发现DHRS4、DHRS4L2和DHRS4L1三个基因mRNA的表达有不同程度的上调。(6)通过亚硫酸盐处理的甲基化PCR检测显示HepG2和HL-7702细胞内DHRS4和DHRS4L1基因启动子区域DNA呈低甲基化状态,DHRS4L2基因呈高甲基化状态,干扰反义RNA能降低DHRS4L2基因DNA的甲基化水平。
　　综上所述,本课题首次克隆了DHRS4L1基因mRNA的全长序列,通过生物信息学方法分析整个 DHRS4基因簇的结构和转录特点,提出选择性转录起始位点调节DHRS4L2和DHRS4L1转录本exon1剪接缺失的可能机制,并通过实验证实反义RNA对DHRS4基因簇的转录活性和DNA甲基化的调控作用。该研究结果有助于明确参与DHRS4基因簇转录调控的可能因素,为今后进一步研究 DHRS4基因簇在人体内的功能以及反义RNA调控正义链基因转录活性的作用机制提供参考资料。

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第一章 DHRS4L1基因选择性剪接亚型的克隆

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

附图 1-S DHRS4L1 RNA剪接亚型序列鉴定图

第二章 DHRS4基因簇结构和转录亚型分析

1 材料和方法1. 1 生物数据库

2 结果

3 讨论

参考文献

第三章反义RNA介导DHRS4基因簇DNA甲基化和转录调控

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

附图3-S 亚硫酸盐处理的DHRS4基因簇启动子CpG岛序列鉴定图

结 论

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