CRISPR/Cas9介导hFAD3基因在牛NCAPG-LCORL位点定点整合研究

摘要

本研究利用CRISPR/Cas9介导，将无抗性无标记基因的hFAD3基因表达盒定点敲入牛NCAPG-LCORL位点，研究hFAD3基因的表达对脂肪酸含量，位点旁侧基因以及脂肪酸相关基因表达的影响，获得定点整合阳性单克隆细胞的效率，同时比较有无MAR序列介导转基因细胞中hFAD3基因的表达量，结果如下:
　　1.针对牛NCAPG-LCORL位点成功构建了Cas9切割载体:pCas Guide-B。利用人工合成人源化hFAD3基因，成功构建了5种hFAD3基因定点整合载体:C2(5'arm-CAG-hFAD3-PolyA-3'arm)、M2(5'arm-MAR-CAG-hFAD3-PolyA-MAR-3'arm)、P2(pGT-C1-LHA-RHA-hFAD3)、C22(LHA-CAG-hFAD3-PolyA-3'arm)和CRL(LHA-CAG-hFAD3-PolyA-RHA)。
　　2.对转染后细胞DNA、RNA、脂肪酸水平进行分析。1）PCR鉴定及测序结果表明，实现了多种hFAD3基因定点整合载体在牛NCAPG-LCORL位点的定点整合。2）外源基因hFAD3在RNA水平正常表达。3）Real-time quantitativePCR结果表明hFAD3基因整合后，使得位点上游NCAPG基因表达量上调，下游LCORL基因表达量下调。4）运用气相质谱仪对转基因与非转基因细胞及其培养液的脂肪酸含量进行分析。结果表明，hFAD3转基因细胞中ω6/ω3 PUFAs比值(0.565)较非转基因细胞(1.549)显著下降(P＜0.01);转基因细胞培养液中ω6/ω3 PUFAs比值(0.623)较非转基因细胞培养液(0.848)显著下降(P＜0.05)。5) Real-time quantitative PCR结果表明，hFAD3基因表达后，脂肪酸分解相关基因(PPARg、LIFE、LPL)表达量总上调倍数大于脂肪酸合成相关基因(ACC、SCD、FASN)，说明hFAD3基因的表达使得细胞内的脂肪趋于分解。
　　3.通过流式分选以及无限稀释法筛选阳性单克隆细胞。gB+C2实验组共获得59株单克隆细胞，经PCR及测序鉴定，其中定点整合阳性单克隆细胞3株，定点整合效率为5.1％。同时检测单克隆细胞株脂肪酸的含量与位点旁侧基因和脂肪相关基因的表达量，结果与转染后细胞一致。
　　4.比较有无MAR序列介导的转基因细胞中hFAD3基因的表达量，MAR介导组是无MAR介导组的5.91倍(p＜0.01)。
　　综上所述，利用CRISPR/Cas9技术可实现hFAD3基因在牛NCAPG-LCORL位点的定点整合以及在细胞水平的正常表达，同时通过MAR的介导可显著提高外源基因的表达量，为今后安全生产转基因动物提供实验依据。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表

第一部分 试验研究 CRISPR／Cas9介导hFAD3基因在牛NCAPG-LCORL位点定点整合研究

引言

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 pCas Guide-B切割载体的构建及活性验证

2．2 hFAD3基因定点整合载体的构建

2．3 切割载体与定点整合载体共转染渤海黑牛胎儿成纤维细胞

2．4 转染后细胞DNA、RNA、脂肪酸水平检测

2．5 阳性单克隆细胞的筛选及相关检测

3 讨论

3．1 整合位点的选择

3．2 动物安全转基因技术的探索

3．3 核基质结合区(MAR)序列对外源基因表达的影响

3．4 hFAD3基因的定点整合对位点旁侧基因的影响

3．5 hFAD3基因的表达对细胞中ω-6／ω-3 PUFA比值的影响

3．6 hFAD3基因的表达对脂肪相关基因表达的影响

3．7 CRISPR／Cas9技术介导的外源基因定点整合研究初步探索

4 结论

第二部分 文献综述哺乳动物转基因整合位点的选择和鉴定

1 定点整合位点的选择要素

2 常用整合位点介绍

2．1 Rosa26位点

2．2 H11位点

2．3 CSN2位点

2．4 H2-Tw3位点

2．5 Hprt位点

2．6 NCAPG-LCORL位点

3 转基因整合位点的鉴定

3．1 基于PCR的染色体步移技术

3．2 第二代基因组测序技术

4 结语

参考文献

攻读硕士期间发表及待发表的论文

致谢