应用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得高直链淀粉马铃薯

摘要

马铃薯直链淀粉广泛用于医药、食品等工业领域，也是生产抗性淀粉的重要原料。现有马铃薯品种直链淀粉含量仅为总淀粉含量的25％左右，且直链淀粉分离工序损耗大得率低。因此，创造培育高直链淀粉含量的马铃薯品种对于促进我国马铃薯淀粉加工产业发展具有重要意义。
　　CRISPR-Cas9技术能够利用单链RNA引导Cas9蛋白酶对基因组进行定点编辑，是近年来新兴的基因编辑技术，具有高效便捷、多位点同时编辑以及可剔除筛选标记等优势。
　　SBE基因编码马铃薯支链淀粉合成途径的关键酶，具有SBEⅠ和SBEⅡ两个亚型。本研究利用CRISPR技术敲除两个SBE基因，以期获得高直链淀粉含量的马铃薯新品种。试验以SBEⅠ和SBEⅡ蛋白功能结构域第9个外显子20bp序列为靶标，AtU3b和AtU6-1分别启动两个sgRNA，CaMV35S为Cas9蛋白启动子，构建pYLCRISPR/Cas9-MTdi-SBEⅠ-ⅡgRNA载体。通过农杆菌遗传转化获得44个马铃薯转化株，PCR、测序鉴定获得36个阳性转化株。靶序列测序结果表明，有5株在SBEⅠ靶位点上出现突变，1株在SBEⅡ靶位点上出现突变，共出现10种突变类型，包括1bp的插入突变和2-18bp的缺失突变，最高突变率为61.9％。未检测到同时编辑SBEⅠ和SBEⅡ两个靶位点的马铃薯转化株。测产结果表明，除SBEⅡ-1以外，其他转化株的结薯数和产量与对照相比均无显著变化。淀粉含量测定结果表明马铃薯转化株直链淀粉含量均无显著上升。
　　分析影响基因编辑效果的因素，重新优化并构建了新的pYLCRISPR/Cas9-MTdi-SBEI-T1-T2-Ⅱ-T1-T2gRNA载体，转化马铃薯植株，以期获得高直链淀粉马铃薯材料。

目录

声明

摘要

缩略词

一．前言

1．1 马铃薯

1．2 马铃薯直链淀粉及淀粉分支酶

1．2．2 马铃薯直链淀粉特性及应用

1．2．3 淀粉合成途径及相关酶

1．2．4 淀粉分支酶基因(SBE)

1．3 CRISPR—Cas9基因编辑技术

1．3．1 CRISPR技术基本原理及优势

1．3．2 CRISPR技术在动植物中的应用

1．3．3 CRISPR编辑效率的影响因素

1．4 研究目的和意义

二．实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．4 试剂与仪器

2．2．1 设计基因靶序列

2．2．2 CRISPR载体构建

2．2．3 三亲融合法

2．2．4 马铃薯试管苗的培养

2．2．5 农杆菌介导的马铃薯茎段转化

2．2．6 植物基因组DNA的提取

2．2．7 阳性株鉴定

2．2．8 测序检测阳性株打靶效果

2．2．9 盆苗种植及薯块收获

2．2．10 直链淀粉含量测定

三．实验结果

3．1 载体构建

3．1．1 SBE Ⅰ和SBE Ⅱ靶序列选择及合成

3．1．2 载体构建及阳性筛选

3．2．1 转化株的获得

3．2．2 转化株打靶检测

3．3 收获及测产

3．4 直链淀粉含量测定

3．5 载体优化

四．讨论

参考文献

附录

致谢