Fgf21基因敲除小鼠背部皮肤组织miRNA的差异表达分析及其靶基因预测

摘要

小鼠成纤维细胞生长因子21（Fibroblast growth factor21，Fgf21）作为一种重要的调控因子，对毛囊发育及生长周期具有重要作用。本实验室通过CRISPR-Cas9系统构建Fgf21基因敲除小鼠（Fgf21-/-），并通过实验证明Fgf21基因参与毛发生长速度及毛囊直径的调控作用。MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，以碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同诱导沉默复合体降解或阻遏靶mRNA的翻译。最新研究发现，miRNA对毛囊发育调控有重要作用。Fgf21基因在生物化学和遗传学上与miRNA虽然存在一定联系，但是Fgf21、miRNA以及毛囊生长发育机制的相互作用关系尚待明确。
　　1Fgf21-/-小鼠模型的繁育及表型分析
　　利用不同杂合子互交、杂合子与纯合子正反交以及纯合子互交的方式进行Fgf21-/-小鼠模型的繁育，经过基因鉴定最终成功获得45只Fgf21-/-小鼠。表型分析发现，Fgf21-/-小鼠的产仔数目显著减少（p＜0.05），产仔雌雄比例、产仔初生重，整体及雌雄体重生长变化等生理指标均无显著差异（p＞0.05）；通过表达谱分析，生理解剖学分析发现，与WT小鼠相比，Fgf21-/-小鼠的各组织内脏均正常，尤其是Fgf21高表达的胰脏组织并无异常；通过石蜡切片及H&E染色后进行的毛干数目统计发现，Fgf21-/-小鼠的毛干数目显著少于WT小鼠（p＜0.05）。2Fgf21-/-小鼠表皮组织的miRNA测序
　　以Fgf21-/-小鼠和WT小鼠表皮组织为材料，miRNA测序共检出1249个不同长度miRNAs。差异miRNA表达分析的数据统计发现，差异显著的miRNAs共134个（p＜0.05），其中83个表达水平上调，51个下调；结合文献参考，从测序结果共筛选得到10个与毛囊生长发育调控相关的miRNAs，分别为miR-377-3p、miR-335-5p、miR-214-5p、miR-148a-3p、miR-410-3p、miR-411-5p、miR-376b-3p、miR-376c-3p、miR-136、miR-221-3p，之后利用荧光定量PCR（quantitative Real-time PCR,RT-qRCR）进行验证，与测序结果相一致。
　　3miRNA靶基因预测及生物信息学分析
　　利用TargetScan、miRanda两款软件对显著性差异的134个miRNAs（p＜0.05）分别进行靶基因预测后取其交集共得到105,886,298个靶基因。对显著差异miRNA的靶基因进行GO和KEGG富集性分析，最终GO功能注释共得到20,557个靶基因，KEGG注释得到7,881个靶基因。通过GO富集性分析发现有1023个差异显著（p＜0.05）的基因功能属性，其中主要参与Protein binding、nucleus、integral component of membrane、cytoplasm和biological-process的5个功能属性过程；KEGG注释发现202条显著差异（p＜0.05）的信号通路被富集，其中164条信号通路差异极显著（p＜0.01），同时发现与毛囊发育相关的PI3K-AKT signaling pathway、P53signaling pathway、Notch signaling pathway、TGF-beta signaling pathway、TNF signaling pathway5条差异极显著（p＜0.01）的信号通路。最终利用Cytoscape软件分别构建得到以验证成功的10个显著差异miRNAs为核心，集中调控与预测到的与毛囊发育调控相关靶基因的GO/KEGG-miRNA-靶基因的关联图。
　　以上结果中异常表达的miRNA可能参与了Fgf21对毛囊发育的调控。同时上述结果为梳理Fgf21、差异miRNA、靶基因在毛囊生长发育中的相互作用及其关系提供实验数据。

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