大豆抗病毒基因GmNH23的功能域分析及其SMV效应蛋白的鉴定

摘要

植物体内具有化学、物理、生物等多种策略抵抗病原体的入侵，植物防御系统中最重要的一种策略是依赖于由抗性基因（Resistance gene，R）编码的蛋白，其能够特异性识别病原体。大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus，SMV）在全球大豆生产中是最普遍的病毒。SMV是Potyviridae家族中Potyvirus属的成员，其基因组是单链正义RNA，编码10种蛋白质，分别是P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb、CP。对不同SMV株系具有抗性的多个独立抗性基因座已被鉴定，其中大多数是非Toll白介素受体-核苷酸结合位点-亮氨酸重复（Non-TIR-NBS-LRR）类型的R基因。
　　烟草中已经发现了抗TMV的N基因，N基因属于NBS-LRR类的R基因。实验室的前期研究在大豆基因组上发现一个与N基因同源的并对TMV和SMV都具有抗性的基因，将其命名为GmNH23（Glycine max N-Homolog23）。本研究的目的是确定GmNH23编码对SMV具有抗性的功能结构域，将GmNH23蛋白按照结构域预测网站将其分成5个部分，分别为TIR、NB-ARC、DUF、TN（TIR+NB-ARC）、ND（NB-ARC+DUF）。超敏反应（Hypersensitive Response，HR）发现TN结构域对SMV具有抗性。HR实验结果显示TN结构域可能主要与SMV编码的NIa-Vpg和NIa-Pro蛋白相互作用从而发挥抗性作用。同时因为GmNH23基因是N基因的同源基因，所以检测了GmNH23基因编码的结构域对TMV的抗性。实时荧光定量PCR和Northern Blot实验结果表明TN结构域对TMV具有抗性。为了确定tn基因可否在野生型本氏烟草中表达，在tn的N端融合表达HA标签。Western Blot实验结果表明tn基因可以在烟草中表达。通过与TMV共侵染发现在tn的5'端融合表达HA标签会影响其对TMV的抗性，所以在tn的C端融合表达HA标签，发现其对tn的抗性不产生影响。通过在tn的5'端融合表达不同细胞器的信号肽，利用农杆菌瞬时表达发现当与细胞质信号肽、核输出信号肽序列、以及果胶酶信号肽序列融合表达时tn的抗性完全丧失，初步确定抗性基因tn可能主要在细胞核中发挥抗性作用。以上实验为进一步研究大豆抗病基因的作用机制以及与SMV互作的机理奠定了基础。

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